热点;nsored有限公司内容由Rapid Novor Inc .提供的见解来自工业，谢明杰
James Ives对Rapid Novor首席执行官谢明杰的采访
抗体蛋白测序的目的是准确地推导出存在于初级序列中的每一个氨基酸。与原始抗体相比，由一级编码错误序列表达的抗体蛋白可能会引起截然不同的结合行为。即使是初级序列中的单个氨基酸错误也可能对最终的抗体结构产生破坏性影响。
Tatiana Shepeleva
在20种氨基酸中，异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)具有相同的分子量，无法用常规的质谱(MS)实验进行区分。因此，通过传统的质谱方法进行蛋白质测序缺乏可靠的准确性。
为了解决这个问题，我们开发了WILD?。WILD?代表W-ion Isoleucine Leucine Determination technology，利用Ile和Leu之间的结构差异，充分利用MS仪器内置的电子转移高能碰撞解离(EThcD)等先进的碎片化技术，将侧链(图1中的橙色剪刀)断裂，以产生卫星w-离子。在破碎过程中产生的w离子会有不同的质量位移，可以准确可靠地识别特定的残基。
图1所示。w -离子异亮氨酸(WILDTM)测定方法的介绍。橙色剪刀可以精确定位侧链断裂的位置，释放卫星w离子，准确可靠地区分异亮氨酸和亮氨酸。
抗体的互补决定区(CDR)对每种抗原具有高度特异性的序列。因此，CDR中存在的残基的顺序和类型对抗体的功能至关重要。
虽然在重量上等压，但Ile和Leu具有不同的结构，决定了不同的抗体-抗原相互作用。我们观察到，Ile和Leu结构的差异会影响抗体的结合亲和力，在某些情况下，当错误的Ile或Leu残基在CDR区域内或周围时，结合不再发生。
这是一个有趣的问题，因为在cdr中Ile和Leu的数量可能是相当随机的。图2是我们在2018年美国质谱学会年会上发表的海报的修改版本。
海报描述了我们测序的数百种单克隆抗体产生的数据。如你所见，有些抗体在六种cdr中都不含异亮氨酸或亮氨酸。然而，在另一个极端，我们观察到一些病例在cdr中总共有9个Ile或Leu。然而，平均而言，cdr将包含至少3至5个Ile或Leu残基。
图2。在互补决定区(CDR)中表达一定数量异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)残基的抗体频率。
如果没有对这两种异重氨基酸的准确测定，研究人员只能使用排列来预测序列中所有可能的Ile或Leu位置。然而，在许多情况下，这可能既不可行，也不经济。
例如，对于含有9个Ile或Leu的抗体项目，研究人员甚至可能无法生成表达所有500种或更多可能的组合以识别正确的抗体，更不用说功能抗体了。
Edman降解是最常用的蛋白质测序技术。这项技术依赖于一个循环过程，包括化学催化，以协调从肽的n端开始的氨基酸的重复去除，然后通过电泳，色谱和质谱检测氨基酸。
Edman退化有相当大的缺点。首先，该工艺需要大量的原料。其次，由于该过程依赖于在去除之前标记n端，因此无法处理具有不可接近n端的肽。第三，Edman测序通量很低。Edman降解的一个循环可能需要一个小时。
最后，在实践中，Edman降解只能对大约30个氨基酸进行排序。在鉴定所有Ile和Leu残基之前，需要通过电泳或色谱从多肽混合物中分离出含有Ile和Leu的肽，因为传统的质谱实验无法区分Ile和Leu，这项任务既繁琐又低效。对所有含有Ile和Leu的肽进行测序需要几天的时间。尽管Edman测序对阐明抗体序列非常重要，但该技术存在许多缺陷，并且在当今基本上已经过时。
最近，通过酶催化和质谱分析实现了蛋白质裂解成多肽。首先确定目标抗体蛋白上的裂解位点以预测潜在的片段，然后通过质谱实验与观察到的片段进行比较。
通常，胰凝乳酶被用来产生消化模式，可以帮助区分赖氨酸和亮氨酸残基。在过去，我们也使用酶消化抗体。我们注意到，从不同的供应商购买的酶，在不同的条件下使用，对不同的抗体，表现不同。我们还发现酶的错误率非常高，而且这种方法往往是不可复制的和不可靠的。因此，我们寻求开发一种高精度、可重复性和可靠性高的方法:WILD?。
如何使用质谱对抗体蛋白进行测序?
我们的WILD?技术在技术开发和市场认知度方面仍然相当新。但是，我们将继续提高其吞吐量和准确性。目前，WILDTM可以在单轮中以90%的准确率确定样本序列;我们使用其他子弹来确保可重复性和达到100%的准确度。
这种对复杂混合物的额外回合的需求转化为延迟，但随着不断改进，我们希望大大减少吞吐量时间。我们继续对复杂抗体进行精心设计的实验，以便将来我们可以100%准确地确定样品中的所有Ile和Leu残基。我们特别投入并渴望着手确定多克隆和寡克隆混合物中的抗体序列。
我们希望WILDTM技术可以用于指导未来的重组工作，指导疫苗的合理设计和免疫治疗策略。
我们的网站https://www.rapidnovor.com/resources/wild/是有关WILD?信息的重要资源。您还可以在此URL https://www.rapidnovor.com/antibody/找到更多与抗体蛋白测序相关的信息。
谢明杰，理学硕士，工商管理硕士，是Rapid Novor Inc.的联合创始人兼首席执行官。他是一名计算机科学家，获得西方大学生物信息学硕士学位。他获得了理查德·艾维商学院(Richard Ivey School of Business)的工商管理硕士学位，以追求他在商业方面的兴趣。在联合创立Rapid Novor公司之前，他是一家生物信息学软件公司的首席运营官。
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