核酸是一种用途广泛的分子，其应用远远超出了其最初的生物学相关性。合成修饰的核酸在超分子化学和纳米技术的背景下特别感兴趣[1]。过渡金属离子进入核酸的位点特异性结合，即进化优化的自组装特性与金属基功能的结合，大大拓宽了人工核酸的范围。它可以通过金属介导的碱基对来实现，其中互补核碱基之间的氢键被配位键正式取代[2]。为此，许多人工核碱基被开发出来[3,4]。众所周知，典型的核碱基胸腺嘧啶和胞嘧啶可以与汞(II)和银(I)形成同感金属介导的碱基对[5]，人工金属配位核碱基的发展也允许其他金属离子的掺入[6,7,8,9,10]。同样，每个碱基对可以引入一个以上的金属离子[11,12]。甚至在DNA双链内的金属离子阵列[13,14,15,16,17,18]和有机金属DNA修饰也是可能的[9,19,20,21]。具有金属介导碱基对的DNA可用于调节核酸的电荷转移能力[22,23,24,25]，产生金属纳米团簇[26]，设计自适应和响应的纳米系统[27,28,29,30,31,32]，以及开发用于各种分析物的传感器[33,34]。通过金属介导的碱基配对检测寡核苷酸序列引起了人们的特别关注[35]。在这方面已经研究了几种人工核碱基，包括1h -咪唑-[4,5-f][1,10]菲罗啉[36,37]，3-氟-2-汞-6-甲基苯胺[38,39]和3,5-二甲基吡唑取代嘌呤[40]。
我们一直对3,5-二甲基吡唑取代基的体积是否与互补核碱基的识别有关，或者较小的吡唑取代基是否足够感兴趣，因此评估了6-吡唑嘌呤的金属介导的碱基配对能力(6PP，图1)[41]。该研究表明，6PP:C对在加入Ag(I)后会略微不稳定，而6PP:T对则会略微稳定，这表明即使在吡唑残基上没有甲基取代基的情况下，也会对嘧啶残基进行识别[41]。该工作的后续扩展涉及6PP的同属碱基对及其二氮杂衍生物1-二氮杂-6-吡唑嘌呤(1D6PP)、7-二氮杂-6-吡唑嘌呤(7D6PP)和1,7-二氮杂-6-吡唑嘌呤(1,7d6pp)(图1)[42,43]。这些实验确定嘌呤衍生物的沃森-克里克边缘是相关的银(I)结合位点。
图1
6PP的化学表示(包括相关内环氮原子的原子编号方案)，1D6PP, 7D6PP和1,7d6pp (R=H或2 ' -脱氧核糖)，使用在本贡献中应用的配色方案来表示各自的实验数据
出乎意料的是，与母体核碱基6PP (vide infra)相比，二氮杂衍生物在互补嘧啶残基方面表现出不同的银(I)介导的碱基配对性质。这使得我们重新研究了6PP:C和6PP:T对双链物的银(I)结合能力。新获得的数据与deaza衍生物(vide infra)的数据吻合良好，并与已发表的数据进行了对比[41]。对先前报道的结果进行彻底的调查表明，在含6pp的寡核苷酸中，人工核碱基一定是在固相寡核苷酸合成过程中或之后被分解或化学修饰的，而没有被质谱分析跟踪。不幸的是，在该研究中错误地鉴定6pp衍生核碱基的尝试(通过故意合成和表征各种可能的类似分子质量的分解产物)仍然没有成功(数据未显示)。为了纠正化学记录，下面报告重复实验的结果，包括对二氮杂衍生物的实验结果。在这种情况下，单体构建块的合成和表征数据再次部分报道，表明先前报道的可重复性。
该项目使用的所有化学品和溶剂均购自ABCR、Acros Organics、Alfa Aesar、Carl Roth GmbH & Co. KG、Eurogentec、Fisher Scientific、GlenResearch、Merck、Sigma-Aldrich、TCI和VWR。如果合成需要无水溶剂或试剂，则按照标准程序对其进行干燥和蒸馏。只使用无水吡啶，从Acros Organics购买。柱层析纯化使用孔径为60 ?的硅胶60，粒径为35-70 μm，购自Acros Organics和Merck。薄层色谱板DC Silica Gel 60 F254来自Merck. 6PP (1)， Hoffer’s chloro sugar采用先前发表的方法合成[44,45]。元素分析在element Analysensysteme GmbH的Vario EL III CHNS分析仪上进行。
合成寡核苷酸序列所需的磷酰胺从格伦研究公司购买。寡核苷酸链的合成在K&A Laborger?te H8 DNA/RNA合成器上以DMT-off模式按照标准方案进行。合成后，寡核苷酸从固体载体上被切割和去保护。为此，对于含有1D6PP或7D6PP核苷的DNA，使用水溶液氨(25%)和水溶液甲胺(40%)(1:1,v:v)的溶液;对于含有6PP或17d6pp核苷的DNA，使用叔丁胺、水溶液氨(25%)和甲醇(1:1:2,v:v:v)的溶液。如果使用前一种溶液，则在65℃下脱保护15 min，对于后一种溶液，将温度调至55℃，时间延长至3 h。然后，通过变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化寡核苷酸(凝胶溶液:7 M尿素，1 M TBE, 18%聚丙烯酰胺:双丙烯酰胺(29:1);运行缓冲:0.1 M TBE;负载缓冲液:11.8 M尿素，42 mM Tris/HCl (pH 7.5)， 0.83 mM EDTA (pH 8.0)， 8%蔗糖，0.08%染料(二甲苯氰醇，溴酚蓝)。然后在0.1 M的be缓冲液中电洗脱从凝胶中提取DNA，用nap10柱脱盐2次。用MALDI-TOF质谱法对脱盐后的寡核苷酸进行了表征。使用3-羟基喹啉酸/柠檬酸铵基质，在Reflex IV MALDI-TOF或Autoflex Speed MALDI-TOF光谱仪(Bruker)上记录MALDI-TOF质谱。在对寡核苷酸进行定量时，摩尔吸收系数ε260为:6PP, 4.8 cm2 μmol-1;1D6PP, 8.6 cm2 μmol-1;7D6PP, 7.0 cm2 μmol-1;1,7 d6 pp, 2.5 cm2 μmol-1[42]。
采用Bruker Avance(I) 400和Bruker Avance(III) 400谱仪记录核磁共振谱。被调查的样品溶解在从Acros Organics或Sigma-Aldrich购买的氘化溶剂中。对于在1H和13C{1H} NMR光谱中观察到的化学位移的分配，使用了残留溶剂信号。此外，四甲基硅烷(TMS)用于CDCl3的研究，3-(三甲基硅基)-1-丙磺酸钠(TSP)用于D2O的研究。31P{1H} NMR波谱采用正磷酸(c=85%)参考。使用MestReNova软件(Mestrelab Research s.l.)对数据进行评估。DNA熔化实验在CARY 100 Bio紫外光谱仪上进行，使用1 cm石英试管。在AgNO3不存在或不存在的情况下，在pH为6.8 (1 μM寡核苷酸双相，150 mM NaClO4, 5 mM MOPS (pH 6.8)或5 mM硼酸盐(pH 9.0))的缓冲液中，在260 nm处测量紫外熔化曲线，加热速率为1°C min-1，每间隔1°C记录数据。熔化温度由熔化曲线一阶导数的最大值确定。在J-815型CD光谱仪上，使用与紫外熔化谱图相同的样品，在5°C下记录了CD光谱。
6-(1h -吡唑-1-基)- 9h -嘌呤(6PP)(1)[41,44]。
6-氯嘌呤(1.00 g, 6.48 mmol)与吡唑(2.20 g, 32.3 mmol)混合，在150℃下搅拌1 h。冷却后，将DCM (5 mL)加入生成物中搅拌至均匀浆液。将混合物过滤后，用DCM (5 × 5 mL)和Et2O (3 × 10 mL)洗涤残渣，得到化合物1，为浅棕色粉末。产率:1.14 g (6.14 mmol, 95%)。1 h NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ(ppm)=13.17(年代,br, NH), 8.90 (1 h, H5 *), 8.82 (1 h, H2), 8.66 (1 h, H8), 8.09 (d、3 jhh=1.7赫兹,1 h, H3 *), 6.75 (t, 3 jhh=2.7赫兹,3 jhh=1.6赫兹,1 h, H4 *)。(*指吡唑原子)。
9-(2-脱氧-3,5-二- o -对甲苯基-β-d-红戊呋喃基)-6-(1h -吡唑-1-基)- 9h -嘌呤(2)[41]。
6PP (1,480 mg, 2.58 mmol)悬浮在20 mL的干men中。在0℃下加入NaH(60%分散在矿物油中，170 mg, 4.25 mmol)，室温搅拌1h。将Hoffer’s chloro sugar [45] (1.25 g, 3.22 mmol)悬浮在甲苯(20 mL)中，分四步在20 min内加入悬浮液，室温搅拌20 h。经柱层析纯化后(Cy (8):EtOAc (4):Et3N (3):DCM (1);Cy=环己烷)，由乙酸乙酯再结晶，得到化合物2为白色针状晶体。产率:702 mg (1.30 mmol, 51%)。1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ(ppm)=9.01 (d、3 jhh=2.7赫兹,1 h, H5 *), 8.76 (1 h, H2), 8.30 (1 h, H8), 8.01 - 7.95 (m, 3 h, H3 *, Hortho), 7.92 - 7.84 (m, 2 h, Hortho), 7.29 (d、3 jhh=8.0赫兹,2 h, Hmeta), 7.19 (d、3 jhh=8.0赫兹,2 h, Hmeta), 6.64 (dd 3 jhh=8.2赫兹3 jhh=5.8赫兹,1 h, H1的),6.57 (dd 3 jhh=2.8赫兹3 jhh=1.6赫兹,1 h, H4 *), 5.85 (dt 3 jhh=6.4赫兹3 jhh=2.2赫兹,1 h, H3的),4.80 (dd 2 jhh=13.3赫兹3 jhh=5.1赫兹,1 h, H5或H5”),4.71 - 4.61 (m, 2 h, H5“H5”,H4”),3.18 (ddd, 2 jhh=14.4赫兹,3 jhh=8.3赫兹,jhh=6.3赫兹,1 h, H2或H2”),2.90 (ddd 2 jhh=14.1赫兹3 jhh=5.8赫兹,3 jhh=2.2赫兹,1 h, H2或H2”),2.45 (3 h, CH3), 2.37 (3 h, CH3)。(*指吡唑原子)。
9-(2-脱氧-β-d-红戊基呋喃基)-6-(1h -吡唑-1-基)- 9h -嘌呤(3)[41]。
化合物2 (749 mg, 1.39 mmol)在氨水(25% in H2O, 50 mL)和甲醇(50 mL)的混合物中室温搅拌4 h。在0℃真空条件下除去溶剂，用柱层析纯化残渣(Cy (8):EtOAc (5): DCM (3): MeOH(1))。得到白色固体3。产率:294 mg (0.973 mmol, 70%)。1H NMR (400 MHz, method):δ(ppm)=9.11 (d、3 jhh=2.7赫兹,1 h, H5 *), 8.74 (1 h, H2), 8.72 (1 h, H8), 7.95 (d、3 jhh=1.7赫兹,1 h, H3 *), 6.66 (dd, 3 jhh=2.9赫兹,1.5赫兹,1 h, H4 *), 6.58 (t, 3 jhh=6.7赫兹,1 h, H1的),4.62 (dt 3 jhh=6.4赫兹3 jhh=3.4赫兹,1 h, H3的),4.08 (q, 3 jhh=3.5赫兹,1 h, H4的),3.85 (dd 2 jhh=12.1赫兹3 jhh=3.5赫兹,1 h, H5或H5”),3.77 (dd 2 jhh=12.1赫兹3 jhh=4.0赫兹,1 h, H5或H5”),2.86 (ddd 2 jhh=13.3赫兹3 jhh=7.2赫兹,3 jhh=6.0赫兹,1 h, H2或H2”),2.52 (ddd, 2 jhh=13.6赫兹,3JHH=6.3 Hz, 3JHH=3.5 Hz, 1H, H2'或H2 ")。13 c} {1 h NMR (101 MHz, MeOD):δ(ppm)=154.6 (C4), 152.8 (C2), 148.1 (C6), 146.1 (C8), 145.3 (C3 *), 132.5 (C5 *), 123.7 (C5), 110.3 (C4 *), 89.7 (C4), 86.7 (C1), 72.7 (C3), 63.3 (C5), 41.5 (C2)。(*指吡唑原子)。
9-[2-脱氧-5- o -(4,4 ' -二甲氧基三硝基)-β-d-红戊呋喃基]-6-(1h -吡唑-1-基)- 9h -嘌呤(4)[41]。
6PP核苷3 (326 mg, 1.08 mmol)溶解于无水吡啶(5 mL)中。然后将DMT-Cl (455 mg, 1.34 mmol)的无水吡啶(5 mL)溶液滴入前者中，室温搅拌3 h。除去溶剂，粗产物经柱层析(DCM (20):EtOAc (4):MeOH(1))纯化，得到4为白色固体泡沫。产率:402 mg (0.665 mmol, 62%)。1H NMR (400 MHz, CD2Cl2):δ(ppm)=9.11 (dd 3 jhh=2.8赫兹4 jhh=0.7赫兹,1 h, H5 *), 8.71 (1 h, H2), 8.27 (1 h, H8), 7.94 - 7.87 (m, 1 h, H3 *), 7.44 - 7.39 (m, 2 h, Hortho), 7.32 - 7.28 (m, 4 h, Hortho), 7.28 - 7.24 (m, 2 h, Hmeta), 7.23 - 7.18 (m, 1 h, Hpara), 6.80 (dq 3 jhh=8.5赫兹3 jhh=3.1赫兹,4 h, Hmeta), 6.59 (dd 3 jhh=2.8赫兹3 jhh=1.5赫兹,1 h, H4 *), 6.53 (t, 3 jhh=6.5赫兹,1 h, H1的),4.73 (q, 3 jhh=4.7赫兹,1 h, H3的),4.19 (q, 3 jhh=4.7赫兹,1 h, H4的),3.75 (3 h,甲基),3.75 (3 h,甲基),3.48 - 3.32 (m, 2 h,H5和H5”),2.89 (dt, 2 jhh=13.7赫兹,3 jhh=6.4赫兹,1 h, H2或H2”),2.58 (ddd 2 jhh=13.6赫兹3 jhh=6.5赫兹,3 jhh=4.2赫兹,1 h, H2”或H2”)。13 c} {1 h NMR (101 MHz, CD2Cl2):δ(ppm)=159.1 (CqOCH3), 153.8 (C4), 152.3 (C2), 147.7 (C6), 145.2 (Cq), 144.4 (C3 *), 143.6 (C8), 136.1 (Cq), 131.7 (C5 *), 130.4 (Cortho), 128.5 (Cortho), 128.3 (Cmeta), 127.3 (Cpara), 123.3 (C5), 113.5 (Cmeta), 109.3 (C4 *), 87.0 (C4), 86.8 (CqOC5), 85.2 (C1), 72.8 (C3), 64.5 (C5), 55.6(甲基),40.7 (C2)。(*指吡唑原子)。
9-[2-脱氧-5- o -(4,4 '-二甲氧基三硝基)-β-d-红戊呋喃基]-6-(1h -吡唑-1-基)- 9h -嘌呤3'-(2-氰乙基)- n, n -二异丙基磷酸酰胺[41]。
用DIPEA (0.52 mL, 0.38 g, 3.0 mmol)和2-氰乙基- n, n -二异丙基氯磷酰胺(CEDIP-Cl) (0.16 mL, 0.17 g, 0.71 mmol)处理无水DCM (5 mL)中化合物4 (0.36 g, 0.59 mmol)的溶液。将反应混合物在室温下搅拌15分钟，然后除去溶剂。用柱层析法(Cy (1):EtOAc (3):Et3N(0.03))纯化黄色油，得到化合物5的无色油。收率:0.23 g (0.28 mmol, 78%)。1H NMR (400 MHz, CD3CN):δ(ppm)=9.11 (dd 3 jhh=2.7赫兹4 jhh=0.8赫兹,1 h, H5 *), 8.69 (1 h, H2), 8.40 (1 h, H8), 7.90 (dd 3 jhh=1.7赫兹4 jhh=0.6赫兹,1 h, H3 *), 7.39 - 7.34 (m, 2 h, Hortho), 7.27 - 7.20 (m, 6 h, Hortho Hmeta), 7.19 - 7.14 (m, 1 h, Hpara), 6.80 - 6.72 (m, 4 h, Hmeta), 6.62 (dd 3 jhh=2.8赫兹3 jhh=1.6赫兹,1 h, H4 *), 6.49 (dd 3 jhh=7.0赫兹3 jhh=5.5赫兹,1 h, H1的),4.92 (ddt 2 jhh=11.1赫兹3 jhh=6.7赫兹,3 jhh=4.9赫兹,1 h, H3的),4.26 (q, 3 jhh=4.1赫兹,1 h, H4的),3.75 - 3.68 (m, 2 h, OCH2),3.71 (3 h,甲基),3.70 (3 h,甲基),3.62 (dq 3 jhp=10.3赫兹3 jhh=6.7赫兹,2 h, iPr-CH), 3.37 (dd 2 jhh=10.6赫兹3 jhh=3.6赫兹,1 h, H5或H5”),3.31 (dd 2 jhh=10.5赫兹3 jhh=5.4赫兹,1 h, H5或H5”),3.09 (ddd 2 jhh=13.8赫兹3 jhh=6.7赫兹,3 jhh=5.4赫兹,1 h, H2或H2”),2.63 (ddd 2 jhh=13.6赫兹3 jhh=7.0赫兹,3 jhh=5.0赫兹,1 h, H2或H2”),2.55 (t, 3 jhh=6.0赫兹,2 h, CH2CN), 1.19 (d、3 jhh=2.7赫兹,6 h, iPr-CH3), 1.17 (d、3 jhh=2.4赫兹,6 h, iPr-CH3)。31P{1H} NMR (162 MHz, CD3CN): δ (ppm)=148.2, 148.1。(*为吡唑原子)MS (ESI): m/z=827.3408 ([5 + Na]+， calcd。m/z=827.3405)。元素分析(C43H49N8O6P): c63.864.2)， h5.9(计算。6.1)， n13.5(计算)。13.9)。
DFT计算由高斯16包进行[46]。基于CAM-B3LYP杂化交换相关泛函[47]和SDD基集[48]，计算了Kohn-Sham分子轨道。经验色散由具有Becke-Johnson阻尼(BJ)的Grimme色散(D3版本)来描述[49]。溶剂(水)在积分方程形式框架中通过极化连续统模型(PCM)考虑[50]。为了评价7D6PP:C和6PP:C碱基对金属结合能力的差异，我们对每个碱基对的S0几何形状进行了优化，并对它们的能量进行了比较。比较了7D6PP带金属离子和不带金属离子的碱基对的能差与6PP带金属离子和不带金属离子的碱基对的能差。这两个值的差异被用作6PP:C与7D6PP:C在Ag(I)结合后的整体稳定性。对显式水分子的计算在与上述相同的理论水平上进行。使用了几种起始几何形状，并选择了稳定的代表性构象(补充材料)。通过频率分析确定了每个最终几何形状的能量最小值。298.15 K时计算热化学值。两个核碱基杂环之间的角度用Mercury (CCDC)计算[51]，并用CYLview可视化[52]。
摘要。
介绍
材料与方法
结果与讨论
结论
数据可用性
参考文献。
致谢。
作者信息
道德声明
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人工核苷是由吡唑和相应的6-氯嘌呤衍生物合成的，如前所述[41,42]。下面将举例说明6PP(方案1)自动DNA合成所需的酰胺磷合成。更多细节请参见材料和方法部分。
方案1
6-吡唑嘌呤(6PP)脱氧核糖核苷(3)和相应的酰胺磷(5)的合成(a)， 150℃，1 h;b第一步:NaH(1.6等当量)，CH3CN, 0℃，1 h，第二步:Hoffer氯糖(1.2等当量)[45]，甲苯，20 h;c水溶液NH3(25%)，甲醇，RT, 4 h;d DMT-Cl(1.2当量)，吡啶，RT, 3h;e CEDIP-Cl(1.2当量)，DIPEA(5当量)，DCM, RT, 15 min
最初，将6-氯嘌呤在纯吡唑中150℃搅拌，得到游离的人工核碱基6PP(1)[44]。随后与Hoffer ' s氯糖[45]反应生成了受对甲苯保护的β构型2 ' -脱氧核糖2。用氨水脱保护得到游离脱氧核糖核苷3。它与DMT-Cl反应生成化合物4，与CEDIP-Cl反应生成酰胺磷5。该酰胺磷被用于随后的自动固相寡核苷酸合成。各自的二氮杂衍生物被类似地合成[42]。
潜在的X:C和X:T碱基对(X=6PP, 1D6PP, 7D6PP，或1,7d6pp)分别在两个密切相关的DNA双工环境中进行了研究。一般的双工序列如图2所示。之所以选择它们，是因为在相同的序列背景下已经报道了其他几种金属介导的碱基对，从而可以对结果进行比较[4]。总共研究了16种双相化合物(IX - IVX, X=6PP, 1D6PP, 7D6PP, 1,7d6pp)。补充材料包括这些寡核苷酸的质谱表征。
图2
本研究中使用的DNA寡核苷酸序列，包括其编号方案(X=6PP, 1D6PP, 7D6PP，或1,7d6pp)
由于先前固相合成过程中人工核苷6PP的分解/化学修饰存在问题(例如与结构相关的2,6-二(3,5-二甲基吡唑-1-酰基)嘌呤类似[53])，因此对含有6PP和1,7 d6pp的寡核苷酸(叔丁胺，氨水(25%)，甲醇(1:1:2)，55°C, 3 h)采用轻度脱保护条件。结果表明，当寡核苷酸中含有1D6PP或7D6PP而不发生任何分解时，适用于常规快速脱保护条件(aq.氨(25%)，aq.甲胺(40%)(1:1)，65℃，15 min)。
采用温度相关紫外光谱和CD光谱研究了双联物IX和IIX的银(I)结合行为。由于本质上相同的趋势，得到的结果双IX将在这里详细讨论。双工IIX各自的数据见补充资料(图S1和S2)。
图3显示了在不存在和存在不同当量银(I)的情况下双相化合物IX的熔化曲线。还概述了由这些熔化曲线得出的熔化温度Tm。添加1等量的Ag(I) (ΔTm=11℃)后，双相I6PP的熔化温度显著升高(图3a)，而过量的Ag(I)只导致少量的额外升高。这种行为表明形成了金属介导的碱基对[54]。有趣的是，当存在亚化学计量量的Ag(I)(这里为0.5当量)时，观察到双相熔化转变。当只有一个指定的银(I)结合位点可用时，如双相I6PP，双相熔化表明形成了一种动力学惰性金属配合物，导致双相物的一部分不含银(I)，而另一部分含有6PP-Ag (I) -C碱基对。在过量Ag(I)存在的情况下，熔融曲线再次呈现单相，这一事实证实了金属介导碱基对的形成，因为过量Ag(I)预计会以非特异性和较低的亲和力与标准核碱基结合。在双相中观察到类似的行为(图3c)，从而得出类似的7D6PP-Ag (I) -C碱基对形成的结论。该碱基对的稳定性稍低(ΔTm=8°C)。双链化合物(图3b)和(图3d)都含有缺乏内环N1氮原子的6PP衍生物，在添加Ag(I)后不显着稳定。事实上，它们只显示出Tm的微小增加，并且可以渐近拟合。这表明Ag(I)的非特异性结合，可能与双链中的典型核碱基结合。对双相化合物ix进行了类似的观察(图S1)。
图3
与胞嘧啶残基相对x的I6PP、b双工、c双工、d双工的熔解曲线。色标:红色，无Ag(I);黄色:0.5等Ag(I);绿色:1等量Ag(I);绿松石:2等量Ag(I);蓝色:Ag(I)的3等分。用折线绘制的熔化曲线表示双相熔化行为。e这些双相的熔化温度Tm取决于Ag(I)的量的概述。折线表示双相熔化，因此无法确定该区域的熔化温度。核碱基X的化学表示及其相应的双相化合物IX的熔化温度用相同的颜色表示。条件:1 μM双工，5mm MOPS (pH 6.8)， 150mm NaClO4
用Ag(I)滴定双相化合物IX时记录的CD光谱如图4所示。在没有银(I)的情况下，它们基本上都类似于常规B-DNA的CD光谱，在约245 nm处具有负棉花效应，在约280 nm处具有正棉花效应[55]。添加Ag(I)后，双相化合物I6PP几乎没有变化(图4a)和(图4c)。相反，对于双相化合物(图4b)和(图4d)，观察到正棉花效应的强度下降，并伴有轻微的棉花效应红移。在含有非watson - crick型Ag(I)介导的碱基对涉及典型核碱基的双链中，CD谱的这种变化已经被报道过[15,56,57]。因此，这可能被认为是多余银(I)与正在研究的双链物非特异性结合的进一步指示。由于所得到的非特异性dna -银(I)加合物的稳定性取决于确切的寡核苷酸序列，因此它们的形成(伴随着CD光谱的变化)发生在不同的银(I)浓度下。对双相化合物ix进行了基本相同的观察(图S2)。
图4
在Ag(I)含量增加的情况下，胞嘧啶残基位于X对面的I6PP、b双工、c双工和d双工的CD光谱。颜色代号:红色，无Ag(I);黄色:0.5等Ag(I);绿色:1等量Ag(I);绿松石:2等量Ag(I);蓝色:Ag(I)的3等分。条件:1 μM双工，5 mM MOPS (pH 6.8)， 150 mM NaClO4, 5℃
为了评估带有中心X:T对的相应双链的银(I)结合能力，对双链IX和IVX进行了与上述双链IX和IIX相同的表征。同样，双相化合物IIIX的数据将被详细讨论，而双相化合物IVX的高度相似的数据将在补充材料中给出(图S3和S4)。
查看图5和S3，分别显示了双相化合物IIIX和IVX在Ag(I)含量增加的情况下的熔化曲线，清楚地表明Ag(I)的存在并没有显著地稳定双相化合物。Tm与添加的Ag当量(I)的关系(图5e)显示Tm有一个小的渐近增加。在每个双相存在一个Ag(I)的情况下，ΔTm的温度仅为1-2°C，使得X-Ag (I) -T碱基对的选择性形成相当不可能。结合Tm的渐近增加，这些数据强烈表明金属离子的非特异性结合。CD光谱进一步证实了这一结论(图6)。从典型的b - dna型CD光谱开始，在约280 nm处，棉花效应的正强度减弱并伴有红移，这强烈表明结构重排开始转向含有非沃森-克里克型Ag(I)介导的碱基对，涉及典型核碱基[15,56,57]。因此，可以推断，具有中心X:T对的双相IIIX与Ag(I)的初始非特异性结合。在双链IVX中观察到类似的行为(图S4)，其中中心碱基对相对于双链IIIX是相反的。
图5
胸腺嘧啶残基在x对面的双相III6PP、b双相、c双相、d双相的熔化曲线。色号:红色，无Ag(I);黄色:0.5等Ag(I);绿色:1等量Ag(I);绿松石:2等量Ag(I);蓝色:Ag(I)的3等分。e)根据Ag(I)的含量，这些双相化合物的熔化温度Tm概述。核碱基X的化学表示及其相应的双相化合物IX的熔化温度用相同的颜色表示。为了便于比较，图5e与图3e采用相同的比例尺绘制。条件:1 μM双工，5mm MOPS (pH 6.8)， 150mm NaClO4
图6
在Ag(I)含量增加的情况下，胸腺嘧啶残基位于X对面的双相III6PP、b双相、c双相和d双相的CD光谱。颜色代号:红色，无Ag(I);黄色:0.5等Ag(I);绿色:1等量Ag(I);绿松石:2等量Ag(I);蓝色:Ag(I)的3等分。条件:1 μM双工，5 mM MOPS (pH 6.8)， 150 mM NaClO4, 5℃
由于胸腺嘧啶与银(I)的配位需要先使核碱基去质子化(与胞嘧啶的配位相反)[36]，我们也在pH 9.0条件下对双链物III6PP和IV6PP进行了举例研究(图S5)。在没有银(I)离子的情况下，与pH值6.8相比，观察到熔化温度有1-2℃的轻微(但不一定显著)降低。这是意料之中的，因为已知pH升高会因氢键减弱而破坏双链DNA的稳定[58]。在每个双相中加入一个Ag(I)后，III6PP的稳定性ΔTm为5°C (IV6PP为3°C)。虽然熔融温度的增加肯定比pH 6.8时要大，但当绘制Tm与双相III6PP中添加的Ag(I)等量物的曲线时(图S5a)的渐近形状表明不存在特定的结合[42]。令人惊讶的是，在双工IV6PP中，一旦每个双工添加一个以上的Ag(I)，甚至可以观察到Tm的降低(图S5b)。这种减少伴随着CD光谱的一个非常显著的变化。如上所述，这强烈表明了结构重排的开始，指向含有非沃森-克里克型Ag(I)介导的典型核碱基碱基对的双链。由此可见，pH的增加并不有助于6PP和胸腺嘧啶之间形成高度稳定的Ag(I)介导的碱基对。因此，我们避免将碱性条件下Ag(I)结合特性的表征扩展到6PP的二氮衍生物。
为了便于比较熔化温度Tm及其对Ag(I)的依赖性，表1概述了本研究中确定的所有相关熔化温度。如上所述，只有6PP和7D6PP能够与胞嘧啶形成显著稳定的Ag(I)介导的碱基对。一般来说，当嘌呤衍生物X位于双链中富含嘧啶的链(即双链IX)而不是富含嘌呤的链(即双链IIX)时，得到的X - ag (I) -C碱基对似乎更稳定一些。金属介导的碱基对稳定性的序列依赖性并非没有先例[59]。这与先前关于Ag(I)介导的X - Ag(I) -Y碱基配对的研究结果一致，其中X和Y分别为6PP、1D6PP、7D6PP或1,7d6pp[43]。该研究还表明，Ag(I)介导的碱基对在双链中富含嘧啶的链中具有特别高的稳定性，涉及6PP或7D6PP。
表1双相熔化温度T米/℃时Ag(I)的存在和不存在以及熔化温度的变化ΔT米/℃时加入一等量Ag(I)一个
在没有Ag(I)的情况下，所研究的所有双链的CD谱与典型的b型DNA双链相似。随着Ag(I)含量的增加，大多数双相化合物在约280 nm处出现了正棉花效应的红移，同时摩尔椭圆率降低。对于某些双相化合物，在约260 nm处开始出现新的负棉花效应。如上所述，这种光谱特征先前在Ag(I)介导的非沃森-克里克碱基对与典型核碱基组成的双相体中被观察到[15,56,57]。考虑到双链I - IV基本上是相同的(除了它们的序列方向和它们的中心人工碱基对的身份)，人们会期望对所有双链来说，额外的非特异性结合应该是相同的，只是对于那些含有高亲和力Ag(I)结合位点的双链来说，从更高的Ag(I)浓度开始。令人着迷的是，双工I6PP和完全没有显示出任何这些变化(图4a, c)，并且双工I6PP的变化不那么明显。作为第一个近似，那些由Ag(I)介导的碱基对最稳定的双相化合物，在过量Ag(I)存在下，向含银(I)的非沃森-克里克双相结构转变的倾向最小。因此，双相，这是最小的Ag(I)稳定的双相，在报告的一组实验中，是最突出的cd光谱变化之一(图6b)。这一经验法则与先前报道的关于银(I)介导的6PP及其二氮杂衍生物的homo碱基对形成的数据非常一致[42]。在该研究中，只观察到那些形成稳定的Ag(I)介导碱基对的双相化合物，在过量Ag(I)存在下缺乏cd光谱变化。同样，pH值升高通常会破坏DNA双链的稳定性。因此，与pH 6.8相比，在pH 9.0时cd光谱的变化更为明显(参见图6a和S5a;S4a和S5b)。这可能意味着多余的银(I)离子不会非特异性地与典型核碱基结合(例如嘌呤残基的N7位置)，但存在一些结合特异性，这也取决于总双相稳定性(可能还有其他尚未确定的因素)。进一步的研究超出了目前的研究范围，正在进行中，以揭示在过量银(I)存在下，标准B-DNA双链向含银(I)的非沃森-克里克双链的迷人转变。
DFT计算确定了6PP-Ag (I) -C和7D6PP-Ag (I) -C碱基对最可能的结构。原则上，两种结构似乎是合理的。由于可以假设6PP-Ag (I) -C和7D6PP-Ag (I) -C的成键模式是相同的，因此图7仅描述了6PP-Ag (I) -C的两种最初考虑的结构。这些结构被用作DFT计算的起点。
图7
6PP-Ag (I) -C碱基对的可能结构。最初认为碱基对可能包含一个三角形配位的Ag(I)离子或一个线性配位的Ag(I)离子和一个协同氢键。c根据DFT计算，具有三角配位Ag(I)离子的结构是能量最低的结构
计算结果表明，含有协同氢键的结构稳定性较差。无论使用哪种初始几何形状，计算都收敛于图7c所示的6PP-Ag (I) -C对的结构。对7D6PP-Ag (I) -C碱基对进行了相同的观察，该碱基对也采用这种几何结构(所有计算结构见图S6)。有趣的是，计算表明，与7D6PP-Ag (I) -C对的形成相比，无银错配对形成6PP-Ag (I) -C对的稳定性约为5.5 kJ mol-1。这与实验观察到的原碱基对较大的热稳定性(ΔΔTm=3℃)一致。
由于金属介导的碱基对主要也可以包括氢键水分子[60,61]，我们还研究了6PP-Ag (I) -C对中存在一个或两个明确水分子的可能性。然而，能量相关的含水金属介导的碱基对被证明是非平面的(图S7)，这表明它们不是在寡核苷酸双链中形成的。
在研究的8个可能的碱基对(X:C和X:T, X=6PP, 1D6PP, 7D6PP，或1,7d6pp)中，只有6PP:C和7D6PP:C被发现形成稳定的Ag(I)介导的碱基对。含有任何其他组合的双相化合物在等摩尔量的Ag(I)离子存在下都不显着稳定。
对于最初提出的6PP及其衍生物在典型嘧啶核碱基鉴别中的初步应用，可以得出两个结论。首先，6PP和7D6PP确实能够通过银(I)介导的碱基配对区分胞嘧啶和胸腺嘧啶。然而，它们被先前报道的人工核碱基1h -咪唑-[4,5-f][1,10]菲罗啉[36,37]所取代，后者也与胞嘧啶形成稳定的Ag(I)介导的碱基对，但当与胸腺嘧啶在Ag(I)存在下配对时，会导致双相不稳定。在菲罗啉衍生物的情况下，简化的DNA主链用于人工核苷，这将是未来研究的一个有趣的主题，以评估其区分嘧啶核苷的优越能力是由于不同的配体还是不同的主链对6PP和7D6PP的影响。尽管如此，对6PP的简单和直接的合成途径仍然使该核碱基成为检测单核苷酸多态性(snp)的潜在候选者。其次，先前报道的3,5-二甲基吡唑取代嘌呤[40]中存在的额外体积不是胞嘧啶和胸腺嘧啶分化所必需的。再一次，合成的简易性当然是6PP的一个优势。
综上所述，两个人工嘌呤衍生的核碱基已经通过Ag(I)介导的碱基对的形成成功地应用于胞嘧啶和胸腺嘧啶的鉴别。这一特性可能在寡核苷酸序列的选择性检测中得到应用。
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