采用了一种基于管内SPME耦合毛细管LC-DAD的色谱系统，研究了多酚在不同情况下合成纳米银的方法:过量还原剂或银盐、添加阳离子表面活性剂和热合成。优化后的合成条件可定量测定作为还原剂的多酚类物质，如Trolox和绿原酸。在合成过程中对两个不同吸收光谱的色谱峰进行了监测。根据摩尔关系，建立了色谱峰面积与银或多酚浓度之间的线性关系。为了稳定银纳米粒子，使用了不同的阳离子表面活性剂，以评估阴离子(氯离子和溴离子)和烷基链的作用。该方法可用于测定绿原酸的浓度，检测限为34 μM， λ=400 nm。对膳食产品中的绿原酸进行了测定。精密度(RSD=10%)和回收率(97 ~ 100%)均令人满意。
纳米颗粒的合成可以使用植物或其他生物(如真菌、细菌和酵母)的提取物进行[1,2]。植物中存在的某些化合物类(多酚类、类黄酮类和多糖等)在特定条件下可作为金属盐，特别是银盐的还原剂。用这种方法合成的银NPs具有抗真菌、抗微生物、抗原虫和抗癌的特性[2]。传统合成中使用的一些有毒成分(溶剂和强还原剂)在生物合成中被水和更兼容的环境还原剂所取代[3]。但是，如果将含有不同浓度的不同化合物的整个提取物直接用于形成NPs，可能会出现合成控制和再现性方面的一些问题。因此，文献[4,5]成功地测试了利用植物中发现的纯化合物在控制浓度下生物合成NPs的方法。以这种方式获得的AgNPs因其抗菌和抗癌活性而被提出用于生物医学应用[6,7]。
在大多数情况下，从植物提取物中生成AgNP之后，采用成本效益高的技术，如紫外可见光谱法，以建立最佳反应条件。入射光与纳米粒子表面等离子体的相互作用产生局部表面等离子体共振(LSPR)，在400 ~ 440 nm范围内达到最大值。最大值取决于AgNPs及其周围介质的大小、形状和组成[8]。然而，合成条件的变化会引起吸收最大值吸光度的增加或减少，同时SPR波段向更低和更高的波长移动，这可能表明正在发生不同的现象(尺寸变化或尺寸分布、聚集等)。紫外可见光谱法提供的有限且不非常具体的信息可以与电子显微镜(TEM和SEM)等表征技术相补充，以评估形貌，大小和动态光散射(DLS)，以确定流体动力半径。然而，微观技术在区分反应的不同阶段有局限性，因为初始成核的颗粒数量和大小都很低。此外，利用傅里叶变换红外光谱分析了NPs与旋盖剂配体的相互作用。因此，以下的合成是相关的，因为AgNP的性质及其毒性是由既定的合成工艺决定的[9]。
另一方面，在合成介质中也存在其他种类(银离子，还原剂氧化的产物……)，因此，关于它们的信息可能会引起人们的兴趣。其他分析技术，如场流分馏法(FFF)[10]或某些色谱技术，可以实现物种形成，可用于此目的。高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICPMS)对不同尺寸(10-40 nm[11]或1-100 nm[12])的银种(I)和AgNPs的分离均取得了良好的效果。所开发的方法已应用于纺织品[11]和环境水[12]的分析。然而，液相色谱结合紫外-可见LSPR检测的使用在这方面仍未得到探索。只有少数研究使用液相色谱法进行紫外可见检测，获得了与AgNP浓度成正比的响应[13,14,15]。
在分析方法上，已采用生物合成法测定了一些还原剂，如多酚。这些化合物与预防氧化应激引起的疾病有关;因此，他们的分析是相关的食品样品，以确定多酚的含量或食品基质的氧化能力。提出了用多酚还原银盐和分光光度法测定AgNPs的LSPR来生成AgNPs的分析方法。在其中一些实验中，AgNPs是在封盖剂存在的情况下产生的，封盖剂稳定了AgNPs[16]。其他方法是在用柠檬酸盐[17]、壳聚糖[18]和聚乙烯醇[19]稳定AgNP种子的情况下生成AgNP。因此，通过这些方法，NPs的生长(而不是成核)被确定为多酚浓度的函数。
在目前的工作中，初始假设假设IT-SPME-CapLC系统可以提供关于AgNP纳米环境水平可能发生的变化及其水动力半径演变的有用信息[15]。另一方面，AgNPs的生物合成将允许在过量前体(Ag)存在的情况下测定还原剂(Trolox和绿原酸)，其策略类似于经典衍生化。因此，本研究的目的是:(i)研究在不同合成条件下，利用Trolox和绿原酸原位生物合成AgNPs; (ii)利用IT-SPME CapLC定量测定膳食产品中的绿原酸。据我们所知，我们首次使用IT-SPME-CapLC系统来研究合成参数(摩尔关系、温度、表面活性剂的添加)对AgNP生成及其随时间变化的影响。
使用的色谱系统是Agilent Technologies的高性能液相色谱系统，配备LC毛细管二元梯度泵(Agilent 1200系列)和二极管阵列检测。用20厘米长的聚二甲基硅氧烷(PDMS)毛细管柱(含35%聚二苯基硅氧烷(TRB-35, Teknokroma))代替进样环，在毛细管柱中对分析物进行固相微萃取。
利用Varian Cary 60型光纤紫外-可见分光光度计监测AgNPs的生成，记录200 ~ 800nm的信号。Jeol公司的JEM-1010透射电子显微镜(TEM)在100 Kv下工作，用于AgNPs的表征。为了表征悬浮液中AgNPs的流体动力半径，采用ZetaSizer Nano系列(Malvern)在以下条件下进行动态光散射(DLS):温度=25°C，分析时间70 s，测量位置4.65 mm，衰减10。
为了生成AgNPs，使用了以下试剂:氢氧化钠(Scharlau，西班牙)、十四烷基三甲基氯化铵(≥98)(C14TAC)、十六烷基三甲基氯化铵(≥98)(CTAC, Sigma)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(≥98%，Sigma)、四丁基溴化铵(Bu4B)(≥98%，Sigma)、硝酸银(%，VWR Chemicals)、德国Sigma- aldrich公司的Trolox(97%)和绿原酸(>95%)。流动相的制备采用醋酸铵(>98%，Sigma-Aldrich，德国)，十二烷基硫酸钠(>85%)和硫代硫酸钠，来自德国默克公司。
毛细管柱为Zorbax-SB-C18 (35 × 0.5 mm × 5 μm, 80 A)，流动相采用Barnstead Nanopure II体系(含乙酸铵(10 mm)、十二烷基硫酸钠(10 mm)、硫代硫酸钠(1.5 mm))净化后的水制备。后一种试剂用于防止银离子与硫代硫酸盐络合而与固定相发生可能的相互作用。流动相过滤0.20 μm，超声1h，静置1天。流速为12 μL min?1。信号记录在200-800 nm范围内。色谱条件是基于MINTOTA研究组先前的研究[13,14]。在本研究中，采用了20 cm毛细管柱，取得了良好的效果。
其中一个导数峰(tr=0.85 min)高度集中在It - spme的毛细血管中。因此，为避免记忆效应，注射后用水清洗毛细管，并控制注射剂量。
硝酸银浓度为380 μM, TX浓度为25、50、150、250、500 μM。将50 μL硝酸银、50 μL Trolox、15 μL NaOH 1M和35 μL水混合在一个epppendorf瓶中。室温下反应10min后直接注射。在430 nm处监测保留时间为1.0 min的色谱峰(表1)。
表1不同co以Trolox和绿原酸为生物还原剂，对合成条件进行了试验。(步骤A、B、C氮化λ=430 nm，程序D, E, F mo氮化λ=400 nm)
将15微升80 μM C14TAC、15 μL NaOH 1M、50 μL硝酸银、50 μL Trolox和20 μL水混合在Eppendorf瓶中。采用380 μM Ag和25 μM Trolox浓度(摩尔关系为15.2)在430 nm处监测色谱谱(表1)。
以100 μM Ag和3.3 μM的Trolox浓度(摩尔关系为30.3)在不同时间对合成进行监测。按照步骤b的添加顺序和试剂的体积进行合成，分别进行室温合成和热合成(炉内40℃)。在后一种情况下，测试了不同类型的阳离子表面活性剂(C14TAC、CTAC、CTAB和bu4b)。
银的定量采用3.3 μM的Trolox浓度和23、50、100、200 μM的银浓度。在室温下反应17小时后注射。在430 nm处监测色谱峰，保留时间为0.7 min(表1)。
测试了三种合成方法(D、E和F)。银盐和绿原酸的浓度和摩尔关系如表1所示。将15 μL NaOH 1M、50μL绿原酸、50μL硝酸银和35 μL水混合在一个埃本多夫小瓶中。为了在色谱系统中进样，溶液被稀释了5倍。在400 nm处监测色谱峰，保留时间为0.7 min。
对两种不同品牌的生咖啡商业样品进行了分析。根据标记物推荐剂量(品牌1为100 mg/250mL，品牌2为157 mg/250mL)，将每片溶解于250mL水中(通过Barnstead Nanopure II系统纯化)。根据产品规格，将上清液(1:5)稀释至浓度为226 μM。制备了几种稀释度(181、136和90 μM)的样品。
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AgNPs的原位生成程度主要受银盐与还原剂(Trolox和绿原酸)的摩尔关系的影响。该过程首先将银盐还原为金属，并形成含有醌结构的多酚衍生物[17,18]。然后，AgNPs生长，直到它们在悬浮液中稳定下来。碱性介质是使多酚羟基去质子化的必要条件，有利于反应和稳定悬浮液。在文献中，为了提高稳定性，也使用了诸如壳聚糖或阳离子表面活性剂[16]等多糖或NP表面的黄酮结构(apiin)[4]。
采用不同的摩尔关系(过量的前驱体(Ag+)或Trolox)进行合成条件的研究，以监测AgNP的形成，并检查合成的分析可能性，以确定还原剂。按照实验部分和表1的描述对三种合成方法进行了评估，其中它们被命名为步骤A(过量的Trolox)， B(过量的银和固定的摩尔关系)和C(过量的银，在控制温度和使用阳离子表面活性剂)。使用IT-SPME-CapLC-DAD条件，在不同的测试程序下检测到三个色谱峰。观察到一个保留时间为0.85 min的色谱峰，在270 nm处有一个最大值，可能与Trolox衍生物相对应[18]。在LSPR波长范围内，根据所测试的合成条件，检测到保留时间分别为0.7 min和1.0 min的两个色谱峰(图1A和B)。
图1
使用Trolox作为生物还原剂(步骤B, C14TAC)在反应10 min (a)和反应17 h (B)后获得的色谱图及其相应的光谱(λ=430nm)。绿原酸(50 μM)(程序A)在10 min (C)下的色谱图(λ=400nm)
在步骤A中，Trolox的浓度在23 ~ 500 μM范围内变化，而银盐(380 μM)的浓度不变，因此，[Ag]/[Trolox]的关系式为0.8 ~ 15.2(表1)。在430 nm处，在10 min的时间内对合成过程进行监测，形成色谱窄峰，保留时间为1 min。虽然无法识别等离子体带，但在tr=0.7 min时检测到另一个峰值(见图1A)。在测试条件下，保留时间为1 min时，峰面积没有随时间的增加而增加，但峰面积随曲洛克斯浓度的增加而增加。在430nm处，色谱峰面积或峰高与Trolox浓度之间建立线性关系(表2和图2A)。因此(由于[Ag+]是常数)，峰面积与摩尔关系[Trolox]/[Ag]呈线性关系(a=31.97 [Trolox]/[Ag]+8.75, R2=0.9973)。因此，这些条件可以用来量化还原剂。另一方面，峰面积通过电位方程与[Ag]/[Trolox]摩尔关系相关(见图2B)。方程的最小值对应于[Ag]/[Trolox]摩尔关系=2.8，表明AgNPs开始增加的最小关系。这种估计的化学计量可能与trolox稳定纳米颗粒的形成有关[4]。
表2关系峰面积或峰高与试剂浓度的关系不同条件下的浓度(银和还原剂)
图2
用程序A ([Ag]=380 μM，反应10 min， λ=430nm, tr=1min)标定Trolox的图。线性范围:25 ~ 500 μM Trolox n=8。B当Ag+浓度为380 μM时，峰面积(tr=1.0 min)与[Ag]/[Tx]的关系。C程序C ([Trolox]=3.3 μM，反应10 min， λ=430nm, tr=0.7min)校准Ag图。线性范围:25 ~ 200 μM Ag n=8。D定浓度Trolox (3 μM)峰面积(tr=0.7 min)与[Tx]/[Ag]的关系
在工序B中，[Ag]/[Trolox]关系最高=15.2 (Ag最高过量)，银盐浓度为380 μM, Trolox浓度为25 μM。研究了色谱随时间(以小时为单位)的变化情况。为了稳定形成的AgNPs，加入阳离子表面活性剂C14TAC后，第一峰面积显著增加(tr=0.7 min)。17 h后，使用C14TAC的峰面积比不使用表面活性剂的峰面积高3倍。在溶液中可以观察到黄色，表示具有SPR的光谱的第一个峰(最大在400 nm左右)(图1B)。然而，第二个tr=1.0 min的峰保持不变，尽管在峰的高区域0.7 min部分重叠在尾部。如果保留的峰(tr=1.0 min)与第一步形成的AgNPs相对应，则可以解释这一事实。在第一步中，Trolox可能吸附在AgNPs上。Kasthuri等[4]描述了多酚衍生物与金属离子在AgNP表面的吸附，形成胶束结构。与金属离子的结合是通过多酚的羰基发生的(图1S)。以Trolox为例，苯酚氧化形成的醌有一个羰基基团。Trolox作为一种衍生稳定AgNP的稳定性可以解释它不会随着时间的推移而发生任何变化的事实。然而，极化AgNPs对应的峰是随时间增加的峰。峰的增长(与吸光度直接相关)表明形成了最大的种群和较小的尺寸(最大值向较低波长移动)[20]。
与步骤A类似，开发了第三种生物合成过程(步骤C)，保持Trolox浓度恒定并改变银浓度(表1)。因此，在低浓度Trolox (3.3 μM)下，测试了较高的银盐/Trolox摩尔关系(7至60)，并使用C14TAC来稳定NPs。在这些条件下，发现色谱峰的面积和高度(tr=0.7 min)与银浓度呈线性关系(表2)。从分析应用的角度来看，该关系可用于绿色合成AgNPs定量银(图2C)。在430nm处，峰面积与[Ag]/[Trolox]之间可以建立线性关系(a=13.35 [Ag]/[Trolox]?39.28,R2=0.9956)。发现了峰面积与[Trolox]/[Ag]之间的潜在关系(图2D)。在这种情况下，方程的估计最小值对应于24.7=[Ag]/[Trolox]，此时第二类生成的AgNPs开始生长。较高的[Ag]/[Trolox]关系可能表明表面有更多的Ag+，因此更早地从色谱系统中洗脱出更多的极化AgNPs。
最后，在银浓度为100 μM、[Ag]/[Tx]摩尔关系为30和室温条件下，对AgNP的生成进行了监测。峰面积(tr=0.7 min)随时间增加，静置17 h后，溶液呈现黄色。峰的增加可以解释为自催化表面生长(图2S)[21]。Ag+通过电子转移发生在先前形成的AgNPs表面。这一事实可以用峰面积与银浓度成正比来解释。Finke-Watzky模型解释了成核和生长同时发生的机制(更多细节见补充资料第2节)[20,22]。温度对AgNPs合成的影响在补充资料(图3S)的第3节中讨论。
考察了阳离子表面活性剂(烷基三甲基铵型)对AgNPs生成的影响。由于静电相互作用(表面活性剂的正电荷和NP的负电荷)，阳离子表面活性剂分子被吸附在NP表面，为AgNPs提供了一定程度的疏水性[8,23,24]。因此，测试了几种反离子(氯离子或溴离子)和/或最长烷基链长度(十四烷基-或十六烷基-)不同的表面活性剂(CTAC, CTAB, C14TAC, Bu4B)。图4S为使用十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)进行热合成时峰面积(tr=0.7 min)归一化后的结果。使用C14TAC将烷基链长度从C16减少到C14，得到的面积是CTAC的80%。文献[24]描述了通过增加烷基链的长度来更好地稳定NPs。阴离子(溴化物和氯化物)的变化对其影响较大;参见CTAC与CTAB。值得注意的是，一些无机阴离子如硫化物、氯化物、硼酸盐和碳酸盐也可以起到封盖剂的作用[19]。表面活性剂的阴离子可以决定NP的形状，Murphy等人报道了使用CTAB的纳米棒和使用CTAC的球形NP[25]。在目前的研究中，没有证据表明这种形状的变化。阴离子可以形成卤化银并吸附在NPs表面，也可以减少银的还原[26]。具有较短烷基链和溴阴离子(Bu4b)的阳离子表面活性剂效果最差，分散性最高。值得注意的是，在没有表面活性剂(只有水)的情况下，得到的面积是使用CTAC的60%。
最初，用绿原酸测试了特洛昔的方法A，得到了两个峰(0.7和1 min)的色谱图。然而，它们与使用Trolox获得的紫外光谱在峰顶处存在差异(见图1C)。第一个峰的光谱有两个波段。Zhong等人[23]描述了相同形状(球形)和大小(20 nm)但聚集程度不同的aunp的类似现象。光谱的第一个波段在单个粒子的特征波长附近有最大值(对应于四极等离子体激元到耦合球体)，另一个波段位移到更长的波长(对应于偶极等离子体激元共振)。虽然这可能表明第一个峰可能含有不同程度聚集的纳米颗粒，但CGA或其衍生物(与金属或醌的配位产物)在AgNPs表面或粒子间空间之间的影响是不可忽视的。观察到两个波段向较短波长移动以增加CGA浓度。因此，对于其中一个波段，50 μM CGA的最大值为484nm, 500 μM CGA的最大值为464nm。如果CGA或醌衍生物在AgNPs上覆盖较薄的层(浓度较低)，则会发生波长较长的偏移。
与使用Trolox合成不同，两个色谱峰对CGA浓度有响应。在比较这两种化合物时，必须考虑到还原剂和稳定剂的两种功能。CGA的还原能力高于Trolox，可能是因为CGA的芳香环上有两个羟基，而Trolox只有一个羟基[22]。两种化合物中的羧酸基团等极性基团可以使银离子络合，并在AgNP上形成一层涂层。该涂层稳定了AgNPs并促进了它们的生长。其他作者通过傅里叶变换红外光谱验证了AgNPs中c=O与CGA的配位[27]。
另一方面，还采用了绿原酸的不同合成策略。在室温下，不使用阳离子表面活性剂进行稳定，试剂(银和绿原酸)之间的摩尔关系较低。还原剂浓度高于用Trolox合成的还原剂浓度，并在色谱进样前稀释AgNPs。
研究了银和CGA浓度对AgNPs的影响(表1)。在步骤D中，银浓度(410 μM)保持不变，绿原酸浓度在250 ~ 3000 μM范围内变化。在这些条件下，第二峰面积与绿原酸浓度之间存在线性关系，并且发现了[绿原酸]/[银]的摩尔关系(表2)。对于绿原酸的定量，在步骤E中，使用较低的银浓度(50 μM)和绿原酸(100-500 μM)，保持了与步骤d相似的摩尔关系。如表2所示，使用50 μM获得的斜率大于410 μM。
在相同的银浓度(410 μM)下，使用绿原酸(步骤D)比使用Trolox(步骤A)获得了更高的校准图斜率，因此灵敏度更高，尽管在步骤D中摩尔关系也更高。-OH基团的高数量决定了比Trolox更高的CGA还原效率[22]。当CGA浓度为100 μM时，银浓度对AgNPs的影响(表2)将在补充信息的第5节中讨论。
AgNPs的形成可以伴随着高强度的黄色。通过透射电镜(TEM)和色散光散射(DLS)测定AgNPs的大小，分别获得20 nm和34 nm(水动力直径)的值(图3)。其他分析参数如检测限和精度进行了估计。LOD计算为3sb /b, sb为空白标准偏差，b为校正图斜率，得到34 μM。精度表示为n=3为10%的变异系数。
图3
A在AgNPs合成过程中由于绿原酸浓度的增加而引起的颜色变化。B用DLS测量AgNPs的水动力半径。C . AgNPs的TEM照片
采用所提出的方法对两种符合生产厂家标准的含绿原酸的商业膳食产品(绿咖啡A和B)进行了分析。每个样品被稀释至浓度，该浓度在线性范围内。AgNPs的生成采用银浓度为50 μM的条件。两种产品的峰面积与样品中预期浓度之间的线性函数见表3。样品中绿原酸的回收率由校正图标准的斜率与考虑生产厂家给出的浓度的样品(b标准/b样品)的斜率之间的关系计算。样品A的结果为100%，样品B的结果为97%，没有发现基质效应。因此，样品A的测定值为157±16 CGA/片，样品B的测定值为97±10 mg CGA/片。
表3线性关系样本中峰面积与期望co之间的关系ncentrations (n=3)
另一方面，对Trolox的程序A应用于绿原酸的标准溶液和生咖啡的商业样品。在50 ~ 3000 μM范围内发现了两个面积与CGA浓度成正比的峰。具有第一个主峰的轮廓与使用过量银的Trolox方法获得的轮廓相似。在这些条件下，绿咖啡(稀释至30%)的样品被处理，并随着时间的推移监测峰的演变。发现了三个峰值，其中第一个和第三个峰值随着时间的推移而增加(10,42和72 min)(图6S)。除了CGA，咖啡配方中含有的其他多酚也能产生AgNPs。
表4总结了采用色谱、光谱和电化学技术测定各种食品基质中CGA的方法的特点。光谱方法的原理是AgNPs的形成，由于样品中含有的不同种类的多酚在优化条件下与银盐表现出还原剂电位，因此测量了总抗氧化活性(TAC)[16,17]。在我们的工作中，AgNP的合成时间比这些方法优化的时间要短。此外，一些方法采用了几个阶段的样品处理，增加了分析时间。值得注意的是，所得结果与已建立的TAC测定方法具有可比性。在目前的工作中，虽然对程序A样品的定性应用(图5S)表明TAC可以作为色谱峰面积的总和来测量，但尚未考虑该选项。其他方法表现出良好的lod，如使用荧光探针(0.045 μM)[28]或伏安传感器(0.06 μM)[29]。在我们的方法中，LOD不是一个关键的分析特征，因为样品中CGA的浓度很高。Munteanu和Apetrei[29]提出的方法除了分析应用外，还对氧化还原过程进行了研究。以同样的方式，本研究探讨了AgNP的合成及其在CGA测定中的应用。另一方面，由于便携性[30]或稳健性[31]，CGA的主要同分异构体已通过小型化色谱技术和常规高效液相色谱技术测定。在本工作中，目标集中在主要异构体(5-咖啡酰奎宁或绿原酸)上，实现了一种更快速，线性范围宽的方法，并可能应用于TAC的测定。由化学计量学工具支持的色谱图谱(例如，通过程序A获得的)可用于区分来自不同商业来源的样品。
表4与使用色谱、光谱和电化学技术测定CGA的其他报道方法的比较
IT-SPME-CapLC-DAD可以监测不同合成条件下的AgNPs。检测到的两个色谱峰各自具有不同的光谱，在监测合成和试剂浓度时表现不同，表明分离了两种不同的包被AgNPs。因此，IT-SPME-CapLC-DAD能够提供有关合成过程的信息，这是使用其他技术难以获得的。随着时间的推移，更极化的AgNPs的增加表明了自催化生长。过量银的热合成提高了反应的速度。烷基链长度和阳离子表面活性剂的反离子(作为稳定剂)对AgNPs的形成都有影响。较长的烷基链和氯离子比较短的链和溴离子更有利于色谱峰的增加。
由于其化学结构，绿原酸在生成AgNPs方面表现出比Trolox更高的反应活性。使用过量的银和绿原酸/Trolox进行合成，可以获得与银和绿原酸/Trolox浓度成比例的分析信号(峰面积和高度)。在此基础上，建立了绿原酸测定方法，测定时间短(13 min)，线性范围宽，回收率高。虽然该方法的LOD高于其他色谱方法，但它可以用于测定含有几种类型多酚的膳食产品的总抗氧化活性。此外，考虑到这些结果，可以在未来的工作中解决不同商业来源样本的区分问题。
下载原文档：https://link.springer.com/content/pdf/10.1007/s00604-023-05886-w.pdf
