欧洲椋鸟(Sturnus vulgaris)在鸟群中唱歌，在这里被称为群居之歌，是成年鸟类的一种非性的社会行为。群居歌曲被认为是一种内在强化的行为，它是由一种低压力、积极的情感状态所促进的，这种状态增加了鸟群中的社会凝聚力。内侧视前区(mPOA)是一个已知在产生群居歌曲中起作用的区域。然而，在这个区域内潜在的作用于调节歌曲的神经化学系统在很大程度上仍未被探索。在这项研究中，我们使用RNA测序来表征雄性和雌性椋鸟唱群居歌的mPOA基因表达模式，以确定可能参与群居歌产生的新的神经递质、神经调节剂和激素途径。
差异基因表达分析和秩秩超几何分析表明，多巴胺能、胆碱能和gaba能系统与群居鸣叫的产生有关，多受体基因(如DRD2、DRD5、CHRM4、GABRD)在高唱率椋鸟的mPOA中上调。此外，共表达网络分析确定了谷氨酸信号相关基因与歌曲相关的共表达基因簇。其中一个簇含有5个谷氨酸受体基因和2个谷氨酸支架基因，并在与人类社交缺陷相关的神经发育障碍相关的遗传途径中显著富集。其中两个基因，GRIN1和SHANK2，与群居歌曲的表现呈正相关。
这项工作为mPOA在椋鸟无性、群居鸣叫中的作用提供了新的见解，并突出了可能在脊椎动物群居社会互动中发挥作用的候选基因。提供的数据也将允许其他研究人员跨物种进行比较，以确定调节社会行为的保守系统。
鸟类鸣叫在雄性动物中具有吸引配偶和保卫领地的作用[1]。然而，一些物种，如欧洲椋鸟(Sturnus vulgaris)，在繁殖环境之外也以很高的频率鸣叫。在欧椋鸟中，非繁殖环境下的鸣叫由鸟群中的雄鸟和雌鸟都以很高的比率发出，这被认为是鸟类发展和练习歌唱的必要条件，这些歌曲后来在繁殖环境中使用[2,3]。非繁殖环境下的鸣叫也被认为对维持鸟群凝聚力很重要[4]。尽管人们对鸣叫学习和雄性求偶鸣叫的神经调节了解很多，但对促进和维持群居环境下鸣叫的神经机制知之甚少，这里将其称为群居鸣叫。
现有文献大多以内侧视前区为中心，鸟类通常缩写为POM，哺乳动物缩写为mPOA。在这里，我们将这种结构称为mPOA，以表明这些发现可能适用于鸟类以外的鸟类，如下所示。mPOA是一个高度保守的结构，以其在性动机行为中的作用而闻名，但最近也被证明在非性社会行为的控制中也很重要，包括群居歌曲[5]。mPOA病变倾向于增加群居性鸣叫，mPOA中mu阿片受体(抑制受体)的存在和激活刺激鸣叫，提示mPOA在群居性鸣叫中起抑制作用[6,7,8]。研究表明，与群居歌曲相关的积极情感状态与mPOA中阿片相关基因的表达呈正相关[9]，mPOA中mu阿片受体的下调减少了歌唱，打破了积极情感与歌唱行为之间的联系[8]。最近的一项研究结果还表明，mPOA中的mu阿片受体刺激刺激了歌曲的组成部分(即介绍哨声)，减少了潜在的压力信号(即擦嘴)，并诱导了奖励(即条件位置偏好)，这表明mPOA中的阿片活性可能既刺激又奖励群情歌唱行为[10]。虽然阿片类药物研究得最好，但研究集中在动机和奖励的其他候选调节剂上，也涉及多巴胺D1受体[11]，内源性大麻素[12]，可能还有α 2去甲肾上腺素受体[13]在mPOA中参与社交歌唱行为;然而，这些研究受到先前已知的候选基因的限制。可能还有更多的神经化学物质和信号级联在mPOA中驱动这种行为，这些还有待发现。
mPOA是整个脊椎动物高度保守的社会行为网络的一部分[14]。我们已经发现，在群居鸣歌研究中发现的mu阿片受体在mPOA中的作用[8,9,10,15]延伸到啮齿动物的其他非性奖励社会行为(即大鼠的社会玩耍)[16]。因此，在与群居鸣声相关的mPOA中识别新的神经调节剂有望揭示调节脊椎动物其他重要的非性社会行为的关键、保守机制。
本研究旨在揭示与群居歌曲相关的mPOA中潜在的新型神经递质、神经调节剂和激素通路。为了做到这一点，我们观察了成群歌唱的雄性和雌性欧洲椋鸟，然后对来自mPOA的击打进行了rna测序(RNA-seq)，以比较低和高歌唱率的鸟类之间的相对基因表达。我们应用了多种生物信息学方法来深入了解与群居歌曲相关的新候选系统。这些方法包括超几何分析来比较不同性别的表达谱，以及使用多种方法进行共表达分析来发现可能与群居歌曲产生差异相关的“中枢”基因，这些基因可能调节脊椎动物的其他亲社会行为。
22只成年欧洲椋鸟(11只雄性[有睾丸]，11只雌性[有卵巢])被用于这项研究。2019年10月，所有椋鸟都被困在威斯康星州麦迪逊西部的一个农场里。从野外捕获椋鸟不需要特别的许可。它们被认为是入侵物种，不属于濒危物种，也不受美国候鸟条约法案的保护。捕获后，所有的鸟都被安置在威斯康星大学麦迪逊分校的室内不锈钢笼子里。将鸟类置于18L:6D循环(早上6点开灯)中至少6周，以诱导“光难性”状态。这是一种初秋的生理状态，椋鸟开始在大的、混合性别的鸟群中唱歌[17]。所有的研究都得到了威斯康星大学机构动物护理和使用委员会的批准，并符合美国国立卫生研究院的指导方针。
将焦点鸟移至有天然树枝的室内鸟舍(2.12 × 2.4 × 1.98 m)，并给予食物、饮用水和洗澡水。鸟类为雌雄混合群，共8只，雌雄各4只。谈话广播在白天播放，以使鸟类适应声音和外来噪音。所有观测都是在2020年9月至2020年11月期间由同一位观测者在单向镜后进行的。
当4只或更多的鸟在鸟舍里唱歌时，观察就开始了。在每个观察期，根据早期观察到的鸣声率选择雄性或雌性焦点鸟。采用这种策略是为了确保在我们的研究中包括的鸟类的鸣叫率产生的广泛代表性。在鸟舍对目标鸟进行焦点观察，每天20分钟，连续5天。所有的观测都是在每天早上9时至12时之间进行的。在每次观察之前，立即播放一段5分钟的椋鸟叫声录音，以激发鸟舍的歌唱。然后采用点采样的方法对歌曲进行测量。在观察期间，观察者每隔20秒就会收到智能手表的轻微振动提示，并记录下鸟儿是否在唱歌。歌曲的定量测量是在5天内记录的计数数量(最多300个)。观察者还连续记录运动、进食、饮水和激动相互作用。所有的行为数据可在补充资料S1中找到。
最后观察期30分钟后，在鸟舍用网捕鸟，快速斩首处死。我们等待30分钟，因为即时早期基因mRNA在刺激后30分钟达到峰值[18];然而，在这项研究中，我们对与唱歌倾向相关的构成基因表达感兴趣。因此，我们研究了基因表达模式与5个测试天的歌曲测量值之间的关系。大脑用干冰快速冷冻，并储存在-80°C的冰箱中，直到11月完成对最后一只鸟的观察。然后将一只替代的鸟从动物设施的笼子转移到鸟舍，在观察鸟舍中总共维持8只鸟。一旦有4只或更多的鸟再次唱歌，重复上述步骤，直到收集到11只雄性和11只雌性的大脑。
在-15°C下，用低温恒温器在冠状面切割200 μm的全脑切片，并安装在玻璃载玻片上。两个毫米冲床(精密科学工具样品盖，2mm，项目编号:18035-02)的mPOA切片取自每只鸟的单片，分别位于第三脑室周围的大脑中心，尾端至可见的中隔脑束末端和吻端至前连合处(图1)，然后保存在-80°C。mPOA冲床的示例照片可以在图1中找到。
图1
A)内部绘制的椋鸟大脑的一个半球的插图，显示了rna测序的mPOA的位置。在第三脑室周围的大脑中心，距可见的鼻中隔束(TSM)末端略尾侧，距前连合吻侧，取2 mm直径的冲孔。B)其中一个mPOA冲压区域的示例图像
所有测序均由威斯康星大学麦迪逊生物技术中心的下一代测序设备进行。总RNA验证和RNA测序处理的综合方法与我们之前的工作[20]一致，如下:总RNA采用Aurum总RNA脂肪和纤维组织试剂盒(Bio-Rad, Hercules, California)提取。使用NanoDrop One分光光度计验证RNA纯度，使用Aglient 2100生物分析仪验证RNA完整性。纯化后的RNA保存在-80°C，直到送去测序。样品符合Illumina输入指南，然后使用Illumina?TruSeq?搁浅mRNA样品制备试剂盒(Illumina Inc.， San Diego, CA, USA)进行制备。每个文库制备采用poly-T oligo连接磁珠从150ng总RNA中纯化mRNA。然后，用二价阳离子对每个富集poly-A的样品进行碎片化。然后使用上标II逆转录酶(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)将片段RNA合成双链cDNA。用随机引物合成第一链cDNA，然后用DNA聚合酶i合成第二链cDNA。用RNase H处理双链cDNA，去除mRNA，然后用顺磁珠纯化(agcourt AMPure XP珠，Beckman Coulter)。cDNA产物暴露于Klenow DNA聚合酶，该酶将A碱基(腺嘌呤)附着在钝DNA片段的3 '端。DNA片段连接到Illumina独特的双适配器上，在3 '端有一个胸腺嘧啶悬垂。使用Phusion?DNA聚合酶在连接物介导的PCR反应中扩增12个循环，然后使用顺磁珠纯化。使用Agilent HS DNA芯片(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)评估成品文库的质量，使用Qubit?dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)评估成品文库的数量。文库在2 nM上标准化，使用Illumina NovaSeq6000测序仪进行配对端2 × 150碱基对测序。
所有样本(11名男性和11名女性)都有足够的原始读数，因此所有样本都被纳入下游分析。在所有分析中，我们使用2021年斑胸草雀(Taeniopygia guttata)国家生物技术信息中心(NCBI)发布号(2021- zf) (GCA_003957565.4)进行基因注释。我们还检查了稍老的2019年斑胸草雀(Taeniopygia guttata) NCBI Release (GCA_003957565.2)和欧洲椋鸟(Sturnus vulgaris) 2015年NCBI Release (GCA_001447265.1)，但发现结果非常相似，因此将2021年的注释用于所有分析，因为它在注释基因方面最完整。使用RSEM对RNA表达进行归一化[21]，这种方法允许在没有完全测序的基因组的情况下改进RNA-seq组装和定量。2021年斑胸草雀和2015年椋鸟注释的RSEM值可在补充资料S1中找到。
以下所有分析均在R- studio (v.1.3)和R (v.4.1.1)中进行。
样本按性别分开，然后根据鸣声进行中位数分割，在每个性别中创建“低鸣声”和“高鸣声”的鸟类组(低鸣声的雄性;N=6，高唱雄性;N=5，低唱的雌性;N=6，高唱女性;n=5)(图2)。然后，我们使用EdgeR Bioconductor Package, v. 3.1.2[22]对不同性别的高唱歌组和低唱歌组进行了差异基因表达(DGE)分析(共2次分析)。虽然这项工作主要集中在与歌曲相关的基因表达变化上，但我们也进行了DGE分析，比较了雄性和雌性的mPOA，以深入了解非繁殖背景下mPOA的性别差异。
在此之后，我们进行了rank-rank超几何重叠(rho)分析[23]来比较不同性别间基因表达方向的模式。RRHO生成了热图，使我们能够看到两性表达谱中一致(方向相同)和不一致(方向相反)的关系(例如，哪些基因在高唱的雄性和雌性中都持续上调，反之亦然)。
图2
图中为4组鸟类个体鸣叫总数，用于差异基因表达和rank-rank超几何重叠分析。鸟类按性别分开，在雄性和雌性之间根据5天内总采样点的歌声进行中位数分割。低唱和高唱的雄性都比它们各自的歌唱条件下的雌性唱得多
我们使用加权基因共表达网络分析(WGCNA)的通用系统生物学方法，从基因表达数据集创建单尺度基因共表达网络和基因模块[24]。RRHO结果显示，男性和女性差异表达最多的前800个基因之间存在统计学上显著的高重叠，因此将性别结合起来进行网络分析。在网络分析开始之前，每个数据集中样本中低表达的基因被移除，从21,721个原始基因过渡到9,648个过滤基因。
对于第一次分析，生成了一个加权的基因网络(节点)和它们的表达相关性(边)，相关性提高到7的软阈值功率β。在本研究中，所有WGCNA网络的β值都是按照WGCNA作者提出的指南选择的[25]。我们将β值确定为网络拓扑分析中的一个点，在这个点上，β的任何增加都只会导致无标度拓扑模型拟合的边际改善。初始参数为:采用无监督分层聚类;签署模式;最小模块大小=30;deepSplit=2;MergeCutHeight=0.3。由于我们的主要兴趣是两组低鸣鸟和高鸣鸟之间的转录组差异，我们也进行了WGCNA的模块保存分析来比较两组之间的网络连通性。他们创建了两个独立的网络，一个只有低音歌手，另一个只有高音歌手。此外，在低歌唱和高歌唱数据集中不表达的基因被删除，以确保网络在模块保存分析中具有可比性。对8,967个基因的每个数据集进行WGCNA。
生成基因(节点)及其表达相关性(边)的两个加权网络，相关性提高到软阈值功率β为9，其他参数同上。然后，我们使用modulePreservation WGCNA功能来确定哪些共表达基因的模块在两种分析中没有被保存的证据，这意味着这些模块之间可能存在功能差异[26]。在禁用并行化和nPermutations=200的情况下进行分析。
模块保存的统计数据用于确定在低频率数据集(参考数据集)中定义的特定模块是否也可以在高频率数据集(测试数据集)中找到。结果被报告为z统计的摘要(Zsummary)。简而言之，Zsummary是WGCNA排列测试生成的基于密度和基于连通性的保存统计数据的综合度量。对于每个模块，生成4个基于连通性和3个基于密度的保存统计量，每个都有相应的z统计量。如果不保留模块，这些z统计量遵循正态分布;较高的z统计值表明保存统计值更有可能超过偶然预期的值。Zsummary的计算方法是取所有基于连通性和密度的z统计数据的中位数，将它们相加，然后除以2。有关该方法的详细数学解释，请参考原文[26]。Zsummary > 10表示两个网络之间的模块保存程度较高(例如，低歌唱者的蓝色模块与高歌唱者的蓝色模块几乎没有区别)，Zsummary在2 ~ 10之间表示模块保存程度中等，Zsummary < 2表示模块之间几乎没有保存(例如，高歌唱者的蓝色模块的基因与低歌唱者的蓝色模块的基因几乎完全不同)。使用chooseTopHubInEachModule WGCNA函数选择每个模块中的枢纽基因。
多尺度嵌入式基因共表达网络分析(MEGENA)是一种分层聚类框架，允许使用平面过滤网络和多尺度聚类构建基因共表达网络和基因模块[27]。这种方法从给定的组织样本中识别出高度相关基因的嵌套组。与WGCNA不同，MEGENA创建了一个多尺度网络，允许一个网络包含基因相互作用的多种变体(即，一个基因可以在多个模块中找到)。
我们的数据集包括所有动物，并过滤掉低表达的基因。在r中，MEGENA包处理了11,447个基因，并打开并行化(nCores=8)以提高分析速度。FDR截止值、模块显著性p值、连通性显著性p值均为0.05。计算FDR的排列数设置为10，计算连通性显著性p值的排列数设置为100。
为了将MEGENA基因模块与歌曲联系起来，进行了聚类-性状关联(CTA)分析。CTA使我们能够将基因组的表达模式与表现行为联系起来。使用MEGENA软件包中的ModulePrinComps函数对每个模块进行主成分分析[27]，并将模块中所有基因表达水平的第一个主成分用作新变量，称为特征基因(见补充材料S4)。这使每个基因模块作为每个动物的连续变量表示，并允许行为与可能在功能上连接的共同表达基因组相关联。用Pearson相关性比较了模块特征基因与歌唱条件的关系。
对DGE和RRHO产生的基因集以及WGCNA和MEGENA创建的模块进行富集分析。这种方法允许我们输入一个自定义的基因列表，并确定这些基因在具有先前已知功能的大型基因集中是否被过度代表。如果一组自定义基因在功能已知的基因集中被过度表示，它被标记为“显著富集”。这些先前确定的基因集包括分子途径、药物作用、疾病和许多其他因素。使用R中DGCA包中的modullego函数对所有MEGENA模块进行富集，进行一般性探索[28]。用于调查我们感兴趣列表的后续丰富工具包括ToppCluster [29]， Geneontology[30,31]和STRING[32]。所有列出的基本基因功能均使用GeneCards查找[33]。STRING包含了最广泛的富集分析，因此在附加信息中报告了所有感兴趣的基因群的显著STRING富集。
摘要
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结论
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补充材料S2提供了从差异表达最多到差异表达最少的完整基因列表，并提供了表达变化的方向性信息(高歌唱者上调=正信号，高歌唱者下调=负信号)。在男性中，51个基因的校正p值(Benjamini-Hochberg False Discovery Rate, FDR)小于0.05,1389个基因的原始p值小于0.05。在雌性中，校正p值小于0.05的基因只有4个，原始p值小于0.05的基因有888个。
先前的研究表明，未达到FDR阈值的顶级差异表达基因可以通过qPCR成功验证[34]，因此我们预计许多原始p值为0.05的基因仍然具有生物学意义。由于存在大量p值小于0.05的差异表达基因，我们进行了rank-rank超几何重叠分析，以发现男性和女性一致的基因。雄性和雌性表现出显著的相似性，高唱组和低唱组在两性之间表现出显著的重叠(低唱组:p <。在前800个差异表达最多的基因(约占注释基因组的前7%)中，我们发现在雄性和雌性高鸣鸟中，305个基因持续上调，226个基因持续下调。在STRING中对跨性别和谐表达基因的富集分析显示，与动机行为相关的神经调节剂(如多巴胺和乙酰胆碱)以及GABA和谷氨酸的富集显著富集(表1)。此外，toppcluster富集显示了许多与自闭症相关的基因，其中亲和性社会交流受到严重影响。
表1低唱和高唱欧洲椋鸟的mPOA不同的兴趣基因
我们的DGE分析比较了雄性和雌性，发现1194个基因的原始p值小于0.05，其中685个基因在雄性中相对于雌性显著上调，509个基因在雌性中相对于雄性上调。在雌性中，38个显著上调的基因与2021年斑胸草雀NCBI基因组注释的W染色体(ChrW)相关。这些基因没有明显的富集。在该注释中，有165个chrw相关基因，但其中123个基因由于组间计数低而被排除。这使得4个ChrW基因在雌性中相对于雄性没有显著上调。在男性中，383个上调的基因与Z染色体(ChrZ)有关。这些基因在多种代谢过程中富集。该注释有1084个chrz连锁基因，但508个由于计数低而没有差异表达数据。这使得193个ChrZ基因在雄性中相对于雌性没有显著上调。雄性和雌性DGE分析的完整EdgeR结果(雌性表达上调=阳性，雄性表达上调=阴性)也可以在补充材料S2中找到。
图3
(A)维恩图显示了在比较男性和女性高音歌手时，800个表达差异最大的基因的表达重叠。B)通过rank-rank超几何重叠分析生成的热图，比较高唱歌和低唱歌的雄性和雌性内侧视前区(mPOA)， p值表示每个象限内前800个差异表达最多的基因之间重叠的显著性。暖色代表较高的重叠比例，而冷色代表较低的重叠部分。上面给出了完全相关和完全反相关的例子，以供参考。mPOA在男性和女性中的表达谱非常相似，在一致性基因表达中有显著的重叠，而在不一致性基因表达中没有显著的重叠
在最初的WGCNA分析中，鉴定出15个模块(见补充材料S3)，但是没有模块特征基因与歌曲显著相关。虽然没有达到显著性(p=0.086)，但黄绿色模块与歌曲的关系最为密切，由93个基因组成。它包含三个谷氨酸能信号基因(GRM2, GRIN2A, SLC17A6)，一个胆碱能受体基因(CHRNA5)和一个GABA受体亚基(GABRD)。
在模态保存分析中，我们发现了多个模态在高、低歌唱者之间没有被保存。对于高歌唱者数据集，WGCNA鉴定了16个基因模块，而在低歌唱者数据集中鉴定了12个模块。模块保存分析鉴定出3个Zsummary < 2的基因模块，因此在两次分析之间没有保存(图4)。所有模块保存分析结果和感兴趣模块中的基因可在补充材料S3中找到。其中一个是灰色模块，它由“未分配”到任何产生的模块的基因组成，因此该模块没有进一步研究。未保存的粉色模块由241个基因组成，谷氨酸相关基因显著富集(在STRING中)(图5)。这包括CACNG3和CACNG5，两者都是AMPA受体调节蛋白，该模块的中心基因(连接最紧密的基因)是SHISA6，该基因被认为能够使离子型谷氨酸受体结合活性。粉红色模块还显示GABA能突触富集，包含GABA转运体SLC6A1和GABA受体亚基GABRD，这是先前发现的差异表达基因之一。粉色模块包含即时早期基因EGR1，生长激素抑制激素SST，以及两个雌激素相关基因。这包括GEPR1，一种雌激素受体，和CITED4，增强雌激素依赖性的交互激活。147个基因的品红模块也没有在歌唱条件下保存下来，然而，在任何显著的神经通路上都没有显著富集。
图4
WGCNA模块保存分析结果用Zsummary表示，Zsummary是代表模块连通性和密度的z统计量的复合值，与模块大小相对应。不包括灰色模块。如果一个模块的Zsummary < 2，则认为它没有跨条件保存。粉红色和品红是唯一没有在不同条件下保存的模块，而所有其他模块在两个唱歌组中都保持了某种形式的保存
图5
WGCNA粉色模块中的顶部连接基因，该模块在mPOA的歌唱条件下未被保存。少于15个连接的基因被排除在可视化之外。基因符号的字体越大，表明基因之间的联系越多。先前确定的在谷氨酸信号传导中起作用的基因用黑色圆圈表示。中心的大基因(SHISA6)是WGCNA鉴定的该模块的枢纽基因。识别感兴趣模块的协议在“方法”一节中提供
MEGENA确定了542个嵌套模块。CTA鉴定出145个这些模块的特征基因(第一主成分)与歌唱条件显著相关。由于与行为相关的模块众多，我们使用GeneOverlap软件包[35]进行了重叠分析，以确定哪些模块在高歌唱家的305个差异表达基因中显著富集。为了尽量减少由于模块尺寸过大而产生的解释噪声，我们进一步过滤了那些包含超过150个基因且差异表达基因少于5个的模块，留下30个感兴趣的模块(见补充材料S4)。
其中7个模块在谷氨酸通路中显著富集STRING。模块#237包含多个谷氨酸受体基因(GRM5, GRIA1, GRIA2, GRIN1, GRIN2B)和谷氨酸突触支架基因(SHANK2, HOMER2)。该模块包含了先前在与社会障碍相关的人类神经发育障碍中发现的遗传途径显著富集的基因。模块#237的枢纽基因为GRIA1、ADGRB3和SIPA1L1(图6)。另外两个模块的甲状腺激素受体结合显著富集，包括核受体共抑制因子和共激活因子(NCOR1、NCOA6)。有关父模块(嵌套感兴趣模块的较大模块)、中心基因和突出的MEGENA感兴趣模块的特征基因-歌曲p值的信息参见表2。我们绘制了MEGENA鉴定的感兴趣基因之间的关系，并根据原始p值发现song与GRIN1和SHANK2表达之间存在显著的正Pearson相关性(图7)，然而，我们没有对多重检验进行校正。其余21个模块未显示显著富集，未进一步研究。
图6
MEGENA模块#237的顶部连接基因，其特征基因与mPOA中的歌唱状况相关。所有基因在雄性和雌性中均上调。基因符号的字体越大，表明基因之间的联系越多。连接数少于5个的基因被排除在可视化之外。先前确定的在谷氨酸信号传导中起作用的基因用黑色圆圈表示。中间的大基因(GRIA1, SIPA1L1, ADGRB3)是MEGENA鉴定的该模块的枢纽基因。识别感兴趣模块的协议在“方法”一节中提供
表2感兴趣的MEGENA模块
图7
两个谷氨酸相关基因(GRIN1, SHANK2)的表达(RSEM预期计数)与总song之间的Pearson相关性。在聚类性状分析中，这两个基因都属于MEGENA模块，其特征基因与歌唱条件显著相关。总歌声是在5天的观察中记录的点样本总数。暗红色线表示基于原始p值的显著相关性。请注意，这些不包括多次测试的更正
利用多种生物信息学方法，我们已经确定了几个与欧洲椋鸟群居鸣叫有关的候选基因。雄鸟和雌鸟表现出一致的歌唱相关基因表达模式，与高歌唱率相关的mPOA中多巴胺、乙酰胆碱和gaba相关表达升高。我们还发现了一个谷氨酸相关基因的共表达复合体，与歌唱密切相关，其中大多数先前与社会互动严重失调的表型有关[36,37]。
我们通过rho对DGE结果的比较发现，低鸣鸟和高鸣鸟在性别上具有相似的基因上调和下调。我们发现这一点特别有趣，因为低唱歌和高唱歌的群体是由每种性别的唱歌率的中位数分裂产生的，而不是所有鸟类的唱歌率的中位数分裂。在原始鸣唱率方面，高鸣唱的雌性(平均鸣唱率为17.2)与高鸣唱的雄性(平均鸣唱率为64.8)的相似度低于低鸣唱的雄性(平均鸣唱率为8.667)。尽管如此，我们的RRHO比较显示，高唱歌雌性的表达谱与高唱歌雄性的表达谱更相似，在前750个差异表达最多的基因中，有500多个基因表达一致。这是值得注意的，因为它表明这些基因不仅仅是运动活动的代表。
在歌唱相关的方向性方面，我们没有发现任何明显的性别差异，因为我们在歌唱条件下表达差异最大的基因在男性和女性之间基本保持相同。然而，在我们的DGE分析中，在不考虑歌唱条件的情况下，我们比较了雄性和雌性，发现200多个基因在性别之间的表达存在显著差异。尽管这些基因中有许多被丰富用于各种代谢过程，但我们没有发现性类固醇特异性代谢基因的显著差异，如CYP19A1或SRD5A变体(见补充材料文件)，它们分别编码芳香化酶和5a-还原酶。这可能令人惊讶，因为mPOA是一个类固醇敏感的、性别分化的大脑区域[38,39]。然而，mPOA蛋白或基因表达的性别差异通常与类固醇激素浓度有关[40]，而在非繁殖条件下的椋鸟中，类固醇激素浓度极低[41]。因此，在缺乏高循环睾酮和雌二醇的情况下，与性类固醇相关的性分化表达可能不存在。我们确实看到雄激素受体(AR)和雌激素受体(ESR1和ESR2)的表达可能在女性高音歌手中略高，但在男性中没有。这些差异的生物学相关性必须在未来的研究中探索[10,42]。
我们还发现，与鸟类雌性特异性ChrW相关的38个基因在雌性中相对于雄性上调。这一结果与ChrW的性别特异性所设定的预期一致[43,44]。通过DGE分析的ChrW基因中，只有4个基因在性别间没有表现出显著的差异表达，123个基因的数量不足以进行DGE分析。考虑到鸟类ChrW上存在有限的雌性特异性正选择基因，这一结果并不意外[45]。这些基因中的许多可能在Z染色体和其他染色体上有冗余的类似物，从而减少了可检测到的两性表达差异，这似乎是合理的。这些发现有助于增加对雌性鸣禽基因组的认识，而这在历史上一直没有得到充分的研究。
我们发现多种多巴胺相关基因在不同的歌唱条件下表达不同。这些包括D5 (d1样受体)和D2受体，多巴胺转运蛋白(SLC18A2)，蛋白磷酸酶(PPP3CC)和神经紧张素受体(NTSR1)。鸟类和啮齿动物的mPOA中的多巴胺刺激性动机[46,47,48]，包括性动机鸟鸣[49];mPOA通过投射到腹侧被盖区(VTA)直接进入中脑边缘多巴胺能系统，众所周知，VTA参与了许多性和非性环境中的动机[50,51,52]。因此，mPOA中多巴胺相关基因表达的不同模式可能调节歌唱行为的动机方面。
先前对椋鸟的研究表明，mPOA中D1多巴胺受体的最佳水平刺激促进了性动机的雄性鸣叫[53,54];然而，它在群居歌曲中的作用尚未得到广泛研究。先前的研究发现雄椋鸟mPOA内D1-而非d2 -样受体密度与群居鸣叫之间存在强烈的正线性相关性[11]。这与最近研究斑马雀无定向鸣叫的工作不一致，斑马雀无定向鸣叫与群居鸣叫相似，是在无性环境下群居鸣叫[5,55]。研究发现，外周给药D2受体拮抗剂氟哌啶醇可以降低雄性斑马雀的无定向鸣叫率，而D1受体拮抗剂SCH23390则没有影响[56]。这些相互矛盾的发现的一个可能的原因仅仅是因为拮抗剂没有直接注射到mPOA内;然而，在mPOA中多巴胺受体的操纵对群居歌曲的影响尚未得到测试。我们的研究发现，D5和D2在高频率群居鸣叫的鸟类中表达上调，这表明mPOA中的多巴胺受体可能在不同背景下调节鸣叫，但这必须经过实验验证。
我们还发现了多个乙酰胆碱基因在高唱椋鸟中上调，包括胆碱o -乙酰转移酶(CHAT)、胆碱转运蛋白(SLC5A7)和毒蕈碱胆碱能受体(CHRM4)。多项免疫标记研究表明，在斑胸草雀大脑的鸣叫控制系统中存在高浓度的胆碱能蛋白[57,58,59]，通过碳巴酚刺激HVC的胆碱能调节斑胸草雀的鸣叫[60]。然而，关于它在涉及社会行为的大脑区域中的作用的文献是有限的。一项对大鼠的研究发现，将胆碱能受体激动剂直接注射到下丘脑前部-视前区可诱导22 kHz的超声发声，这与焦虑样的负面情绪状态有关[61,62]。虽然群居歌曲是一种与积极情绪状态相关的发声方式[5]，但可能是乙酰胆碱在mPOA内起作用，诱发了情绪突出的发声行为，但这还有待进一步研究。
高鸣禽GABAA型(GABAA)受体亚基β 3 (GABRB3)、α 5 (GABRA5)和δ (GABRD)基因表达上调。在我们的第一次WGCNA分析中，GABRD也是与歌曲最相关的模块的成员。GABRA5和GABRB3的个体基因缺陷与小鼠亲社会行为的减少密切相关，包括社会探索、接触和发声的减少[63,64,65]。同样，GABRD在整个妊娠期间表达失调会导致小鼠在产后与幼崽保持更大的距离[66]。这些研究涉及这些基因的全局操作，因此没有确定具体的作用区域。我们的研究结果表明，mPOA是GABAA受体结合可能影响社会互动的一个区域，这使得它成为一个有希望的区域，可以对GABAA亚基受体基因进行病毒操作，以了解它们在社会环境中对行为调节的具体贡献。
鉴于在引言中回顾的一系列研究表明，mu阿片受体在mPOA中在社交歌曲和歌唱行为伴随的奖励中发挥了作用，我们的分析中没有出现阿片特异性基因，这有点令人惊讶。这是出乎意料的，因为mPOA中mu阿片受体的下调减少了song[8]。然而，先前对伏隔核的研究表明，阿片受体刺激对群居歌唱的影响很小，仅在给予最高受体激动剂剂量时才会发生[15]。考虑到这一点，阿片相关基因在mPOA中的表达信号也可能没有高到足以被RNA-seq检测到。此外，过去的研究揭示了mu阿片受体与群居歌曲之间的曲线，倒u型关系[67]，目前的分析可能遗漏了这一点，需要在未来的研究中进一步研究。
DGE、RRHO和这两种共表达网络分析揭示了许多与歌唱条件相关的谷氨酸相关基因。这一点尤其值得注意，因为WGCNA和MEGENA分别使用单尺度和多尺度拓扑结构将功能相关基因聚类在一起，两项分析都强调了谷氨酸能系统与歌唱状况有关。许多这些谷氨酸相关基因与重度抑郁症和神经发育障碍的富集通路相吻合，这两种疾病都以社交失调为特征，抑郁症与快感缺乏特别相关[68,69,70]。考虑到群居歌曲具有高度社会性，并且与奖励(即享乐)状态密切相关[10,71]，这些发现表明，mPOA是谷氨酸调节影响奖励、群居社会互动的关键位点，但尚未得到充分研究[5]。
我们使用MEGENA确定的与歌曲相关的一个模块包含7个谷氨酸受体和突触支架基因，所有这些基因都是社会交际缺陷神经发育障碍研究的兴趣基因[36,37,72,73]。我们发现，与歌曲显著相关的NMDA受体亚基GRIN1在功能上与社会互动的调节有关。GRIN1敲低小鼠已被鉴定并用作自闭症模型[37,74,75]，雄性na?ve小鼠促肾上腺皮质激素释放因子神经元中GRIN1激活缺失会增加社会压力[76]。我们发现与群居歌曲相关的另一个功能相似的基因是SHANK2，一个谷氨酸突触支架基因[77,78]。SHANK2敲低小鼠也被提出作为自闭症模型[36,79,80]，其敲低已被证明会导致na?ve小鼠的社交能力缺陷[81]，并减少大坝的亲代纽带[82]。有趣的是，研究发现通过DREADDS激活mPOA在这些母亲中重建了社会联系，突出了SHANK2在附属互动中的区域特异性重要性。我们鉴定的GRIN1和SHANK2可能是在mPOA内调节社交行为的候选基因，这与本文献一致。
在WGCNA中发现的与歌唱状况相关的一个中心基因是辅助AMPA受体亚基SHISA6[83]，而在MEGENA中发现的另一个中心基因是另一个AMPA受体亚基GRIA1。虽然目前还没有关于SHISA6在mPOA中的功能作用的研究，但最近在小鼠身上的研究表明，小鼠伏隔核(NAc)中SHISA6表达增加与社交互动减少有关[84]。此外，NAc中AMPA受体的拮抗作用增加了社交回避大鼠的社交互动[85]。NAc与mPOA间接相连，因为它是VTA接收输入的激励和奖励回路的一部分，而VTA则接收来自mPOA的输入[50,51,86]。NAc也与VTA和mPOA有直接的、相互的联系[87,88,89]。NAc也被证明可以调节椋鸟的群居鸣叫[10,15,90]，因此我们的mPOA结果表明AMPA受体可能通过这一奖励回路来调节鸣叫的产生。由于被鉴定为谷氨酸AMPA受体复合物相关的枢纽基因，SHISA6和GRIA1成为直接操纵mPOA以揭示其在群居歌曲的动机和产生中的特定作用的优秀候选者。
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