人类诱导多能干细胞(hipsc)可以分化为患者特异性心肌细胞，已广泛应用于心脏病建模、药物研发和再生医学。长QT综合征3型(LQT3)是一种较为恶性的先天性长QT综合征(LQTS)变体，具有SCN5A对门控钠通道的功能获得效应。此外，LQTS基因的主要致病变异是单核苷酸替换(错义)和小插入/缺失(INDEL)。CRISPR/Cas9基因组编辑已被用于创建等基因hiPSCs，以控制相同的遗传背景并分离单个核苷酸变化的致病性。在这项研究中，我们描述了一种优化的、快速的方案，利用核糖核蛋白(RNP)和单链寡核苷酸(ssODN)将一种杂合lqt3特异性变异引入健康对照hiPSCs。基于该方案，我们成功筛选了携带LQT3杂合致病变异(SCN5A±)的hiPSCs，高效率(69个中的6个)，并在2周内证实无脱靶效应，核型正常，碱性磷酸酶活性高，多能性不受影响，体外胚胎形成能力强。此外，我们还提供了将hipsc稳健地分化为心肌细胞的方案，并使用多电极阵列评估电生理特性。该方案也适用于在hipsc中引入和/或纠正其他疾病特异性变异，用于未来的药理学筛选和基因治疗开发。
先天性长QT综合征(LQTS)是最常见的原发性遗传性心律失常综合征，可导致猝死风险，估计每2000人中就有1人发生。已经鉴定出15种常染色体显性基因与不同的LQTS亚型[1]和单核苷酸替换(错义)相关。小插入/缺失(INDEL’s)是在LQTS基因中发现的遗传变异的主要模式。LQTS 3型(LQT3)是先天性LQTS中最恶性的亚型，其INa通道(由SCN5A编码)的功能获得(GOF)变异导致NaV1.5失活受损[2]。这导致在延长等电ST段后患者心电图上出现T波峰值形态[3,4](图1、2和3)。
图1
sgRNA和ssODN设计用于单核苷酸编辑。(A) sgRNA设计及体外合成。首先，目标核苷酸(致病变异)位于sgRNA的3 '，靠近Cas9切割位点，通常位于原间隔器相邻基序(PAM)上游3-4nt(5 '侧)。然后使用商业试剂盒合成由靶互补CRISPR RNA (crRNA)和辅助反式激活crRNA (tracrRNA)组成的CRISPR系统。(B) cas9诱导DNA双链断裂(DSB)后同源性直接修复(HDR)的ssODN设计。100 nt的ssODN模板包含41 nt同源的左臂(HLA)和36 nt同源的右臂(HRA)。还建议在PAM中引入同义(沉默)突变，以避免重组后的重新切割
图2
利用氖转染系统电穿孔RNP复合物进入hiPSCs。(A)制备RNP(由sgRNA和Cas9蛋白组成)、细胞和ssODN的电穿孔反应混合物。使用氖气移液器转移100 μl混合物，并在氖气移液站内连接。(B)选择程序“1300 V, 30毫秒，1脉冲”，按“开始”进行电穿孔
图3
HiPSC-CM分化及MEA记录。(A) hipsc的心脏分化方案示意图。(B)我们研究中使用的MEA平台(Axion BioSystems)。(C) MEA数据记录中AxIS软件的参数设置。(D)在CytoView MEA板上镀hipsc来源的心肌细胞。(E) MEA上典型的传导速度和场电位
人类诱导多能干细胞(hipsc)具有个性化医疗的主要优势，因为它们可以从特定患者的人类体细胞中重新编程，而不存在利用胚胎干细胞(ESCs)的伦理和技术挑战。此外，由于hiPSCs具有自我更新能力，它们能够在体外无限扩展，然后分化成各种细胞类型，包括心肌细胞。hipsc具有巨大的潜力，可以生成忠实反映患者病理生理和潜在细胞病理机制的研究模型[5,6]。尽管有这些优势，hipsc在疾病建模领域的一个主要挑战是区分异常的体外疾病表型和背景异质性[7]。为了克服这一障碍，合适的等基因hiPSC系被认为是疾病建模研究和控制遗传背景效应的最准确平台[8,9]。考虑到这一目标，可以使用基因组工程方法生成等基因的hiPSC系。
目前，主要有三种基因组编辑技术:锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)和聚集规则间隔短回语重复序列(CRIPSR)。ZFNs和TALENs都使用巨核酸酶(FokI内切酶)蛋白通过蛋白质-DNA相互作用来识别和结合特定的DNA序列[10,11,12]。然而，它们的准确性和特异性不如CRISPR/Cas9，而且蛋白质的设计、合成和验证更耗时，技术挑战性大，效率低，并且相对具有细胞毒性，这可能限制了它们的常规使用[13,14,15,16]。因此，使用向导RNA (sgRNA)和CRISPR-associated (Cas)核酸酶的CRISPR/Cas9系统因其高效、准确、成本效益高、易于使用而成为基因组编辑的主导技术[17,18,19,20]。
在CRISPR/Cas9系统中，sgRNA 3 '端的一个保守的3bp DNA序列(NGG)被称为原间隔器邻近基序(PAM)，它与RNA-DNA杂交体的方向相反，是Cas9识别目标DNA序列所必需的。一旦sgRNA识别特定位点，cas9诱导的DNA双链断裂(DSB)就会发生。在宿主细胞中DSB之后，损伤通过两种主要的内源性细胞修复途径之一连接，即非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)[21]。NHEJ是效率较高的主要途径，可广泛用于研究目的，用于开发敲除策略来研究编码蛋白的功能丧失(LOF)[22]。尽管NHEJ途径是体内主要的修复机制，但它容易在DNA修复中引入错误。hdr介导的基因组编辑通过同源染色体DNA或外源DNA模板的存在显示出极高的准确性和无错误修复。因此，HDR是体外引入/纠正特定致病变异以概括/挽救疾病基因型和表型的首选和最精确的方法，但效率相对较低，仍然是一个研究挑战[23]。
在CRISPR/Cas9系统中，最有效、应用最广泛的非病毒传递过程是电穿孔，它可以将RNA/DNA/蛋白质快速传递到靶细胞中[24]。此外，Cas9蛋白与sgRNA可形成无DNA格式-核糖核蛋白(RNP)复合物[25,26]，其分子量低于质粒DNA，可逃避细胞mRNA机制的抑制[27,28,29,30]。这使得基因组编辑成分可以短暂表达，然后通过降解迅速从细胞中清除，从而在各种细胞类型中提高编辑效率，减少潜在的脱靶效应[31]。为了实现最佳的基因治疗技术，我们还需要开发更有效的递送工具以及更有效的sgrna[32]。除了Cas9/gRNA外，单链寡脱氧核苷酸(ssODNs)必须在DNA修复位点可用，作为HDR通路的模板[33]。
在该方案中，我们使用公开可用的设计工具(https://zlab.bio/guide-design-resources)，选择了基因组编辑具有高靶向潜力和低脱靶风险的最佳候选sgRNA，并为我们感兴趣的特定目标变体设计了ssODN。然后我们使用Neon转染将RNP复合物(sgRNA/Cas9)和ssODN一起电穿孔到hiPSCs中。我们也用一种非常简单的方法将这些hipsc分化成心肌细胞。这些方案也可用于纠正疾病相关的致病变异进行基因治疗。
合成sgRNA和ssODN的PCR寡核苷酸从Integrated DNA Technologies订购
用于脱靶分析的PCR引物从Eurofins Genomics订购
GeneArt?精密gRNA合成试剂盒(Invitrogen， #A29377)
TrueCut Cas9蛋白v2 (Invitrogen， #A36496)
TE缓冲液(Invitrogen， #12090015)
超纯dna酶/无rna酶水(Invitrogen， # 10977-035)
Tris基地(Fisher， #BP152-1)
二水乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA) (Sigma-Aldrich， #E5134)
醋酸(Sigma-Aldrich， #A6283)
氢氧化钠(NaOH) (Sigma-Aldrich， #S5881)
琼脂糖(Sigma-Aldrich， #A9539)
SYBR安全DNA凝胶染色剂(Invitrogen， #S33102)
100 bp DNA阶梯(新英格兰生物实验室，#N3231)
DNA凝胶加载染料(6 ×)(新英格兰生物实验室，#B7025)
低范围ssRNA阶梯(新英格兰生物实验室，# 0364s)
RNA负载染料(2 ×) (New England Biolabs， #B0363S)
NEBuffer r3.1 (New England Biolabs, #B6003S)
丹麦血液和组织试剂盒(Qiagen， #69504)
蛋白酶K (> 600mAU/ml;试剂盒,# 19131)
RNase A (100 mg/ml;试剂盒,# 19101)
3 M NaOAc (Sigma-Aldrich, #567244)
异丙醇(Sigma-Aldrich， #I9516)
乙醇，分子生物学等级(Fisher Scientific， #16606002)
AllTaq Master Mix套件(Qiagen， #203144)
QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen， #28104)
Essential 8?Flex Medium (Gibco， #A2858501)
Geltrex?LDEV-Free, hESC-Qualified，降低生长因子基底膜基质(Gibco， #A1413302)
Matrigel生长因子还原基膜基质(康宁，#356230)
KnockOut? DMEM (Gibco, #10829–018)
KnockOut?血清替代(Gibco， #10828028)
TrypLE?Select酶(1 ×)，无酚红(Gibco， # 12563-011)
温和细胞解离试剂(STEMCELL Technologies， # 100-0485)
ROCK抑制剂/ Y-27632 (STEMCELL Technologies， #72304)
RevitaCell?补充(Gibco， #A26445-01)
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement (Gibco， # 31331-028)
l -谷氨酰胺(Gibco， #A2916801)
非必需氨基酸溶液(NEAA) (Gibco， # 11140-035)
盘尼西林-链霉素(Gibco， #15070063)
β-巯基乙醇(Gibco， #31350010)
PSC心肌细胞分化试剂盒(Gibco， #A29212-01)，包括心肌细胞分化培养基A (A29209-01)，心肌细胞分化培养基B (A29210-01)和心肌细胞维持培养基(A29208-01)
STEMdiff?心肌细胞分离培养基(STEMCELL Technologies， #05026)
STEMdiff?心肌细胞支持培养基(STEMCELL Technologies， #05027)
牛纤维连接蛋白血浆(Sigma-Aldrich， #F1141)
Dulbecco 's磷酸盐缓冲盐水，含MgCl2和CaCl2 (Sigma-Aldrich， #D8662)
Dulbecco 's磷酸盐缓冲盐水，不含钙，不含镁(Gibco， # 14190-144)
碱性磷酸酶染色试剂盒II (Stemgent， #000055)
Tween-20 (Sigma-Aldrich, #655204)
AggreWell 400板(STEMCELL Technologies， #34815)
RNeasy迷你套件(Qiagen， #74104)
QuantiNova逆转录试剂盒(Qiagen， #205411)
Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, #4385612)
PCR支原体检测试剂盒I/C (PromoCell， #PK-CA91-1096)
从Eurofins Genomics订购了多能标记物(OCT4、SOX2和NANOG)和心脏标记物(ACTN2、TNNT2、MYL2、MYH6、MYH7)的qRT-PCR引物
兔抗oct - 4a (IgG)一抗(Cell Signaling Technology， #2840)
兔抗sox2一抗(Cell Signaling Technology， #3579)
兔抗nanog一抗(Cell Signaling Technology， #3580)
小鼠抗ssea4 (IgG3)一抗(Cell Signaling Technology， #4755)
小鼠抗tra -1 - 60 (IgM)一抗(Cell Signaling Technology， #4746)
小鼠抗tra -1 - 81 (IgM)一抗(Cell Signaling Technology， #4745)
山羊抗sox17一抗(R&D Systems， #AF1924)
小鼠抗α-肌动蛋白，平滑肌(α-SMA)一抗(Cell Marque Corp， # 202m -95)
兔抗β3-微管蛋白(TUJ1) (IgG)一抗(Cell Signaling Technology， #5568)
小鼠抗肌钙蛋白T一抗(ThermoFisher， #MS-295-P1)
小鼠抗α-肌动蛋白一抗(Sigma-Aldrich， #A7811)
兔抗myl2一抗(Proteintech， # 10906-1-AP)
山羊抗小鼠IgG (H + L) Alexa Fluor 555二抗(Cell Signaling Technology， #4409)
山羊抗兔IgG (H + L) Alexa Fluor 488二抗(Cell Signaling Technology， #4412)
驴抗山羊IgG flu488二抗(ThermoFisher， #A11055)
Neon?转染系统(Invitrogen， #MPK5000)
Neon?转染系统100μL试剂盒(Invitrogen， #MPK10096)
组织培养板，6孔(Sarstedt， #83.3920.300)
组织培养板，12孔(Sarstedt， #83.3921.300)
组织培养板，24孔(Sarstedt， #83.3922.300)
组织培养板，96孔(Sarstedt， #83.3924.300)
15ml离心管(Sarstedt， #62.554.502)
50毫升离心管(Sarstedt， #62.547.254)
微离心管，1.5 ml (Sarstedt， #72.690.001)
Cell Scraper (Sarstedt, #83.1831)
低温管(Thermo Fisher， #363401)
Mr. Frosty冷冻容器(Thermo Scientific， # 5100-0001)
μ-slide 8孔(ibidi Gmbh， #80826)
NanoDrop?2000/2000c分光光度计(Thermo Scientific， #ND-2000)
Veriti梯度热循环器(应用生物系统，#4375786)
StepOnePlus?实时PCR系统(应用生物系统公司，#4376600)
共聚焦显微镜FV1000(奥林巴斯)
Maestro Original (Axion BioSystems)
CytoView MEA 48平板(Axion BioSystems)
UCSC基因组浏览器，UCSC人类基因组浏览器:https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?hgsid=582958475_8MBq3n1SNhypj2lRHFl3oCfRsrrd&redirect=manual&source=genome.ucsc.edu
BLAST，人类基因组在线工具:https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
底漆设计工具:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ [34]
集成DNA技术上的CRISPR/Cas9引导RNA (sgRNA)设计工具:https://eu.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM [18]
SnapGene Viewer: https://www.snapgene.com/snapgene-viewer
AxIS Navigator, CiPA分析工具:https://www.axionbiosystems.com/products/mea/mea-software
摘要。
介绍
材料
方法
预期的结果
数据可用性
代码的可用性
参考文献。
致谢。
作者信息
道德声明
# # # # #
1.
sgRNA设计 
计时1天
1.1
根据患者致病变异信息(SCN5A c.1231G>A，外显子9)，在UCSC Genome Browser上进行全基因组DNA测序。
“物种”:智人
《人类大会》:2013年12月(GRCh38/hg38)
“位置/搜索词”:SCN5A (ENST00000333535.9) - chr3:38548062-38649687 -智人钠电压门控通道α亚基5
“序列和链接到工具和数据库”:基因组序列(chr3:38,548,062-38,649,687)。
“序列检索区域选项”:选择5 ' UTR外显子，CDS外显子，3 ' UTR外显子和内含子。
“序列格式选项”:外显子大写，其他所有内容小写。
点击“提交”下载SCN5A基因序列。
1.2
使用Integrated DNA Technologies (IDT, USA)的公开设计工具(https://zlab.bio/guide-design-resources)设计单链引导RNA (sgRNA)用于引入SCN5A c.1231G>A变体。
点击“踊跃”
“设计定制gRNA”-“物种”:智人，“输入格式”:FASTA序列
选取目标致病变异周围201bp的野生型(WT)基因组DNA序列(Human Gene SCN5A ENST00000333535.8):
>SCN5A gctcccccagACCCTCAGGTCCGCAGGGAAGATCTACATGATCTTCTTCATGCTTGTCATCTTCCTGGGGTCCTTCTACCTGGTGAACCTGATCCTGGCC 
TGGTCGCAATGGCCTATGAGGAGCAAACCAAGCCACCATCGCTGAGACCGAGGAGAAGGAAAAGCGCTTCCAGGAGGCCATGGAAATGCTCAAGAAAGAA (*)
＊
颜色表示不同的兴趣。
单击“设计”
根据靶上得分、靶外得分和侧翼位置，选择最佳的sgRNA。
5 ' - ttgcgaccacggccaggatc -3 ' (-) PAM: AGG, On-target score: 57, Off-target score: 85。
1.3
基于sgRNA设计单链供体寡核苷酸(ssODN)，通过同源直接修复(HDR)引入感兴趣的变异:
GGTCTCAGCGATGGTGGCTTGGTTTTGCTCCTCATAGGCCATTGCGACCA 
GGCCAGGATC 
TTCACCAGGTAGAAGGACCCCAGGAAGATGACAAGC (100-nt) (*)
＊
颜色表示不同的兴趣。颜色表示所选sgRNA的PAM序列。
1.4
根据选定的sgRNA (TTGCGACCACGGCCAGGATC AGG)，选择潜在的脱靶位点。
单击“显示非目标详细信息”。
点击“导出到Excel”下载潜在脱靶站点的完整列表。
根据脱靶分数和错配数量，以及电压门控钠通道(SCN)基因家族中另外两个基因(SCN8A和SCN9A)，选择预测值最高的前14个脱靶位点进行脱靶分析。
1.5
脱靶位点序列被上传到Nucleotide Blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&link_LOC=blasthome)以定位基因组染色体位点。
“数据库”:基因组+转录数据库
选择“Human genomic plus transcript (Human G+T)”
点击“爆炸”
在“图形摘要”中选择100%匹配的蓝色片段，点击查看染色体位置信息，如果与步骤1.4中的脱靶信息匹配，点击“比对”查看详细信息。
点击“图形”查看这个脱靶位点的序列，然后点击“放大”，在这个短脱靶位点序列的两侧包括大约1kb的长度。
点击“下载”-“下载FASTA”-“FASTA(可视范围)”
1.6
将下载的DNA序列上传到Primer-Blast网站，设计PCR引物进行脱靶PCR和测序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)。
PCR模板:按照步骤1.5下载序列。
“数据库”:选定生物体的基因组(仅限初级参考汇编)
“有机体”:智人
点击“获取引物”
选择产物尺寸大于350bp，左右臂至少100bp的引物。
2.
sgRNA合成 
6小时
2.1
使用GeneArt?精密gRNA合成试剂盒合成sgRNA。根据选取的sgRNA [5 ' -(+)TTGCGACCA
GGCCAGGATC(-)-3 ' AGG]，两个正向和反向重叠的寡核苷酸核苷酸目的DNA序列和Tracr片段+T7引物混合物的设计和订购如下。
转发:5 ' -TAATACGACTCACTATAGTTGCGACCA GGCCAGGATC-3”(38-nt)
反向:5 ' -TTCTAGCTCTAAAACGATCCTGGCC TGGTCGCAA-3”(35-nt)
注意:如果gRNA包含一个5'G，它可以被删除，因为Tracr片段已经包含一个3'G。
2.2
将有序的正反寡核苷酸重新悬浮在TE Buffer中(10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA;pH 8.0)，得到浓度为100μM的原液。在80μl无核酸酶的H2O中分别加入100μM正反向寡核苷酸原液各10微升，形成10μM目标寡核苷酸混合原液，稀释至0.3μM，进行下一步操作。
2.3
设置sgRNA DNA模板合成反应(25μl)如下:
Phusion?高保真PCR Master Mix (2×) (12.5μl)
商用示踪片段+T7引物混合物(1μl)
0.3μM正向和反向寡核苷酸混合物(1μl)
无核酸酶水(10.5μl)
采用以下循环进行组装PCR:初始变性98oC 10s (1x);变性98oC 5s，退火55oC 15s (32×);终延伸72oC 1min (1x);4摄氏度(持有)。
2.4
PCR产物电泳凝胶。
一)
制备50×TAE (Tris-Acetate-EDTA)缓冲液
Tris基(242g)
冰醋酸(57.1ml)
0.5M EDTA溶液(pH 8.0) (100ml)
用dH2O调节音量至1l。
可选:也可使用商用50倍TAE缓冲液，用dH2O稀释至1倍。
B)
用SYBR安全DNA凝胶染色剂(0.01% v/v)制备1.5% (w/v, 1× TAE缓冲液)琼脂糖凝胶。
C)
取PCR产物5μl，与凝胶上样染料1μl (6×)混合，用100bp DNA Ladder上样电泳。
注意:预期的波段应该在120bp左右。
2.5
按以下顺序设置体外转录(IVT) (20μl):
NTP混合物(ATP、GTP、CTP、UTP各100mM) (8μl)
gRNA DNA模板(直接从步骤1)(6μl)
5× TranscriptAid?反应缓冲液(4μl)
转录辅助?酶混合(2μl)
放置于37℃，孵育3小时。
注:如果需要更多的sgRNA，反应体积可以加倍。如果需要更高的sgRNA产量，孵育时间可延长至4小时。
2.6
在反应混合物中加入1微升DNase I (1U/μl)，在37℃条件下消化DNA模板和寡核苷酸15 min。
注:IVT步骤后会形成白色沉淀物，其中含有焦磷酸盐和少量RNA。但是，这不会影响接下来的净化。
2.7
然后用gRNA Clean Up Kit纯化sgRNA。简单地用无核酸酶水(180μl)调节IVT反应体积(20μl)至200μl，然后与100μl Binding buffer充分混合。加入1体积(300μl) 96%乙醇，转入GeneJETTM RNA纯化微柱中纯化sgRNA。纯化后的sgRNA用20μl无核酸酶的水洗脱。
注意:净化步骤应在室温下进行。需要额外的空离心机步骤，因为残留的乙醇(在洗涤缓冲液中)可能抑制RNA纯化。
2.8
与RNA负载染料(2×)溶液混合，在70℃下加热10分钟，然后用低范围ssRNA梯子进行2%电泳，以确定sgRNA的质量。
注:预期区间在100-nt左右。
2.9
用Nanodrop 2000分光光度计测定sgRNA的浓度，然后在-80℃保存至需要时保存。
3.
在体外 用RNP?进行消化 
6小时
我们建议在电穿孔前对sgRNA进行体外消化。
3.1
通过培养RNP复合物(由sgRNA和Cas9蛋白组成)和含有切割位点的DNA片段，验证CRISPR/Cas9系统的体外效果。首先，使用dnasy Blood & Tissue Kit从对照hiPSCs中分离基因组DNA。简单地说，用蛋白酶K和RNase A预处理细胞颗粒，在Buffer AL中裂解，然后与乙醇混合，转移到DNeasy Mini Spin Column。分离的DNA在缓冲液AE中洗脱(10mM Tris-HCl, 0.5mM EDTA;pH值9.0)。
3.2
建立20μl PCR反应，扩增DNA片段如下:
AllTaq Master Mix (2×) (5μl)
引物正向(10μM) (0.5μl)
引物反向(10μM) (0.5μl)
基因组DNA模板(50ng/μl) (2μl)
无核酸酶H2O (12μl)
使用以下循环进行PCR组装:初始PCR激活95oC 2min(1次);变性95oC 5s，退火60oC 15s，延伸72oC 10s (40×);4摄氏度(持有)。
3.3
PCR产物采用QIAquick PCR纯化试剂盒进行纯化。简单地，将PCR反应与5体积缓冲PB(含pH指示剂I和3M醋酸钠)混合，然后转移到QIAquick柱上纯化PCR产物。纯化后的DNA片段用50μl Buffer EB (10 mM Tris-HCl;pH值8.5)。
注:加入3M醋酸钠调节pH值，使DNA与色谱柱膜结合。
3.4
为了在体外形成RNP复合物，将反应组装如下:
无核酸酶水(20μl)
NEBuffer r3.1 (10×) (3μl)
300nM sgRNA (3μl)
1μM Cas9蛋白(1μl)
在25℃下孵育10min。
3.5
然后加入步骤3.3中纯化的30nM底物DNA 3μl，充分混合，37℃孵育1小时。
注:双链DNA的ng/μl到nM的换算公式如下:
浓度(nM)=(浓度(ng/μl) / (660g/mol × PCR产物大小(bp) × 10^ 6
3.6
加入1微升蛋白酶K，充分混合，室温孵育10min。
3.7
片段分析采用1.5%琼脂糖凝胶。
注:Cas9处理后可观察到两个小片段，大小之和应与PCR产物一致。
4.
hipsc的制备(无馈料，无xeno条件 
7天
用Geltrex涂层和Essential 8 Flex培养基(E8)在6孔板中培养hiPSCs，如下图所示。所用细胞系分别为https://hpscreg.eu/user/cellline/edit/NUIGi038-B[35]和https://hpscreg.eu/user/cellline/edit/NUIGi018-A。
注意:建议在细胞解冻后进行至少2次传代，然后再进行电穿孔。
4.1
解冻hiPSCs
一)
在50ml Knock-Out DMEM中加入500μl Geltrex，混合得到1倍Geltrex溶液(1:100稀释)。
注:稀释后的Geltrex溶液可在4℃下保存4周。
B)
对于6孔板的2孔涂布，我们在每孔中加入1ml Geltrex溶液。
C)
将板置于37℃，5% CO2培养箱中1-2小时。
D)
将一小瓶冷冻保存的hipsc从液氮中转移到37℃的水浴中，快速解冻细胞，直到只剩下一小块冰。
注意:快速解冻细胞以尽量减少对细胞膜的损害是很重要的。在水浴解冻期间，不要松开小瓶，因为这可能会增加污染的风险。
E)
用70%乙醇喷雾小瓶，然后转移到生物安全柜。
F)
使用1ml的过滤头将内容物从小瓶转移到15ml的管中，管中有9ml的E8培养基，补充10μM的Y-27632 (E8Y)。
注:ROCK抑制剂Y-27632的加入对提高PSC恢复生存率有重要意义[36]。
G)
在200×g下离心4min，抽吸上清。
H)
将细胞颗粒重新悬浮在2ml E8Y培养基中，并将种子置于涂有凝胶蝶呤的细胞培养板上。
我)
移动板在几个快速，短，前后和左右的运动，以分配细胞聚集体。将培养皿放回培养箱。
J)
24小时后介质切换为E8介质，每天刷新，直到70~80%的合流。
注:理想情况下，3~4天细胞融合度可达70~80%，可传代。
4.2
hiPSCs的传代
一)
从培养的hiPSCs中抽吸培养基。
B)
加入1ml DPBS(不含Ca2+或Mg2+)冲洗细胞，轻轻摇板，吸出DPBS。
C)
加入400μl的温和细胞解离试剂(GCDR)，室温孵育6~8min，直至位于菌落边缘的细胞之间出现间隙。
注:GCRD是一种无酶试剂，适用于将hipsc解离成细胞聚集体进行常规传代。应在显微镜下监测解离，直到根据外观确定最佳时间。
D)
抽吸GCDR，然后加入2ml E8培养基分离细胞聚集体。
注意:避免过多的移液细胞，因为它可能会降低细胞传代后的存活率。
E)
将细胞聚集体按适当比例转移到涂有凝胶trex的6孔板上。
F)
轻轻移动平板使细胞聚集体分布。将培养皿置于37℃，5%CO2培养箱中。
G)
第二天，用2ml E8培养基更换培养基。
H)
每隔一天刷新一次媒体。
我)
在第3~4天，IPSCs将达到70~80%的融合度，准备进行另一次传代。
5.
利用氖转染系统进行电穿孔 
计时4小时
5.1
Y-27632 (ROCK抑制剂)在终浓度为10μM的条件下处理约70%融合度的IPSCs 2小时。
注意:ROCK抑制剂可能会导致梭形细胞形态，然而，这种变化是暂时的，在去除ROCK抑制剂后会逆转。
5.2
使用0.5× TrypLE Select(1:1稀释在不含Ca2+或Mg2+的DPBS中)将IPSCs分离成单个细胞，然后重新悬浮在含有1% (v/v) RevitaCell Supplement (E8R)的E8培养基中[37]。
注意:分解成单个细胞是非常重要的，因为细胞聚集可能会影响电穿孔效率。
可选:CloneR (STEMCELL Technologies， #05888)在我们的研究中也显示出非常高的菌落存活率。
5.3
将合成的sgRNA和Cas9蛋白在TE Buffer中稀释至终浓度为10μM(分别为800ng和3.2μg)。
注:Cas9蛋白的大小为160kDa，故10μM的Cas9为10(μM) × 160(kDa)=1600 μg/ml=1.6μg/μl。
5.4
设置下面的材料，形成核糖核蛋白(RNP)复合物:
sgRNA (10μM, 800ng) (2μl)
TrueCut Cas9蛋白(10μM, 3.2μg) (2μl)
缓冲液R (6μl)
轻轻混合，室温孵育10~15min[38,39]。
注:RNP络合物的体积不应超过电穿孔反应的10%。
5.5
1×10^6个hiPSCs纺丝后重新悬浮在100μl的Buffer R中。
5.6
然后电穿孔反应建立如下:
RNP复合物(10μl)
细胞悬液(0.2×10^6 hiPSCs) (20μl)
ssODN模板(10μM) (10μl)
缓冲液R (70μl)
5.7
使用Neon移液器将100μl的电穿孔混合物小心地转移到100μl的Neon针尖上。
注意:转移电穿孔混合物时要小心，避免移液管中出现气泡，因为它可能在电穿孔过程中引起电弧，从而导致转染失败。
5.8
选择程序“1300V, 30ms, 1pulse”[40]，然后按“开始”。
注意:确保虹霓移液器的金属头与虹霓移液站内部的球柱塞和虹霓管紧密连接是非常重要的。
6.
Subclo宁与单细胞衍生克隆扩增 
12天
6.1
电穿孔后立即将细胞重新悬浮在E8R培养基中。
6.2
手工挑选单个hiPSC并直接播种到涂有geltrex的96孔板上。
6.3
15至18小时后，进行显微镜检查，将仅含有一个hiPSC的孔标记为膨胀。
6.4
电穿孔后第2天将培养基改为E8培养基，每2天更新一次。
6.5
一周后，在96孔板上观察单细胞衍生菌落，然后用GCDR传代到12孔板上扩增。
6.6
4 ~ 5天后，用GCDR分离hiPSC菌落，然后将~20%的hiPSC传代到新的12孔板上传代培养。收集剩余的~80%细胞进行基因组DNA提取[41]。
7.
靶向PCR筛选 
6小时
7.1
从单个hipsc衍生菌落中分离基因组DNA(步骤6.6)。
8.
收集细胞颗粒。
可选:细胞颗粒可在-80℃冷冻直至DNA分离。
B)
将细胞颗粒重新悬浮在200μl DPBS中(不含Ca2+或Mg2+)。
C)
加入20μl蛋白酶K和4μl RNase A (100mg/ml)，室温孵育2min，去除蛋白和RNA。
D)
加入200μl缓冲AL，旋涡，56℃孵育10 min，使细胞裂解，消化蛋白质和RNA。
E)
加入1μl pH指示剂，10μl 3M NaOAc至悬浮液变黄。
F)
加入310μl异丙醇沉淀DNA，室温涡流孵育5min。
G)
涡旋30秒，然后在12,000×g, 4℃下离心30分钟。丢弃上清。
H)
轻轻加入500μl 70%乙醇洗涤DNA微球，在12,000×g下4℃旋转5min。小心地除去乙醇。
我)
在12,000×g快速旋转，并使用10μl的尖端尽可能地去除乙醇。
J)
将DNA颗粒在室温下风干一夜。
K)
用20~50 μl缓冲AE重悬DNA颗粒，准备PCR扩增。
注:与使用RNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)进行基因组DNA分离相比，该方法具有相似的效果和更低的成本。
7.2
按照步骤3.2和3.3的步骤组装和纯化PCR。
7.3
纯化的PCR产物(5ng/μl, in 15μl)提交给Eurofins Genomics进行Sanger测序。
8.
脱靶分析 
6小时
8.1
20-nt的sgRNA旨在将Cas9蛋白引导到特定基因内的特定目标位置，Cas9被设计用于在PAM序列上游约3~4bp处切割DNA。然而，sgRNA和基因组DNA之间的相互作用可以容忍一些潜在的比对错配，导致基因组其他地方潜在的脱靶核酸酶活性[42,43]。
8.2
使用步骤1.6设计的脱靶引物组装步骤8中编辑成功的筛选菌落的基因组DNA。(表1)
表1潜在脱靶位点信息及引物设计
8.3
纯化的PCR产物提交给Eurofins Genomics进行Sanger测序。
9.
基因组编辑的hiPSC克隆的表征nes? 
1个月
9.1
基因组编辑的hiPSC克隆根据步骤4的方案在E8培养基中扩增培养。
9.2
hipsc的低温保存
当细胞达到70~80%的融合度时，我们冷冻保存一定比例的细胞用于生物库。
一)
抽吸培养基，加入1ml E8Y培养基。
注:ROCK抑制剂预处理有助于提高hiPSCs冷冻/解冻后的存活率。
B)
在37℃，5%CO2培养箱中培养1小时。
C)
使用Cell Scraper分离细胞，然后将所有细胞转移到15ml离心管中。
D)
在200×g下离心4min，抽吸上清。
E)
将细胞颗粒重新悬浮在1ml冷冻保存培养基中(90%敲除血清替代物(KOSR)和10% DMSO)。
注:KOSR是一种无动物和无异种培养基。
F)
将冷冻瓶放入Thermo Scientific?Mr. Frosty?冷冻容器中，并在-80℃的冰箱中放置一夜。
注意:将细胞重新悬浮在冷冻保存介质中后，尽快将冷冻液转移到-80℃。在低温保存介质(含DMSO)中长期保存可使细胞活力降低。
G)
第二天，将冷冻液转移到液氮罐中。
注意:在-80℃的冷冻室中长期储存也可能降低解冻后hiPSCs的活力。
9.3
采用碱性磷酸酶染色试剂盒II检测碱性磷酸酶活性。简单地说，将第3天的hiPSCs固定并用DPBS(含0.05% Tween-20)洗涤，然后与新鲜制备的AP底物溶液在室温下黑暗孵育10~15min，直到图像捕获。
9.4
提取基因组DNA进行分子核型阵列检测拷贝数变异(CNV)和短串联重复序列(STR)分析。
注:基因组DNA提取应包括RNA酶a和蛋白酶K预处理，以去除RNA和蛋白质。
可选:STR分析可以在Eurofins Genomics中作为Cell Line Authentication (CLA)进行，也可以使用我们设计的引物对扩增的PCR产物进行16个位点的电泳凝胶[35]。
9.5
采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测多能性基因的表达，免疫荧光染色检测多能性蛋白的表达。
一)
使用RNeasy Mini Kit提取RNA。简单地说，收集hipsc并在Buffer RLT中裂解，然后与1体积的70%乙醇混合。将匀浆后的裂解液转移到RNeasy旋转柱中。分离的RNA在DNase/RNase-free H2O中洗脱。
B)
使用QuantiNova逆转录试剂盒将一微克RNA用于合成酶cDNA。首先用基因组DNA去除混合物孵育去除RNA样品中潜在的基因组DNA，然后用试剂盒提供的RT酶和混合物进行逆转录(RT)反应。
C)
采用实时荧光定量PCR (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测SYBR Green Master Mix中多能基因mRNA的表达水平，以管家基因GAPDH为内对照。
9.6
通过内胚层、中胚层和外胚层细胞的体外胚体(EB)形成来评估其自发分化能力。
D)
将hiPSCs分离并在AggreWell 400板中旋转，培养24小时形成EBs。
E)
将EBs转移到无包膜的6孔板上，在EB培养基中悬浮培养7天;
DMEM/F-12, GlutaMAX补充剂384ml。
KOSR 100ml, Final: 20%
l -谷氨酰胺5ml, Final: 1%
MEM非必需氨基酸溶液(NEAA) 5ml, Final: 1%
青霉素-链霉素5ml，终品:1%
β-巯基乙醇1ml，终品:0.2%
3)
取单个EBs，将其植入涂有geltrex的载玻片中，培养4周，使其自然分化。
(四)
第28天，将细胞固定，用三种胚层标记物进行免疫荧光染色:内胚层用SRY-Box转录因子17 (SOX17)，中胚层用α-肌动蛋白平滑肌(α-SMA)，外胚层用β3-微管蛋白(TUJ1)。
V)
采用FluoView 1000共聚焦显微镜采集图像。
10.
hipsc的心肌细胞分化 时间:14天
10.1
第1天，6孔板中的hiPSCs在E8Y中处理2小时，然后用GCDR分离成单细胞。
注意:使用高质量的hipsc(很少或没有分化菌落)非常重要。
10.2
3.5×10^5 (350k)将hiPSCs接种于涂有geltrex的12孔板上，在37℃下用E8R培养基孵育24小时，达到90%的融合度。
注:起始播种细胞密度对于从hipsc中高效分化心肌细胞至关重要。我们建议在电镀后24~48小时内细胞密度达到80~90%汇合度时开始心脏分化。
10.3
分化第0天使用PSC心肌细胞分化培养基A，分化第2天使用培养基B。从第5天开始，应用心肌细胞维持培养基(CMM)，每隔一天更新一次。
注:所有心脏分化培养基保持4℃。死亡细胞在第2天和第5天脱落是正常的。
10.4
在分化第14天，人工解剖自发跳动的心肌细胞团，然后用STEMdiff?心肌细胞解离培养基在37℃下孵育10min，使心肌细胞聚集体解离成单个细胞。
注:可以通过添加心肌细胞支持培养基来停止分离。
10.5
在300×g离心5min。
10.6
将细胞颗粒重新悬浮在含有1% RevitaCell补充剂的STEMdiff?心肌细胞支持培养基(CSM)中进行下游工作。
11.
心肌细胞表征 
时间:14天
11.1
将密度为50k/200μl的心肌细胞接种于Matrigel (1:100 (v/v)在KnockOut DMEM中稀释)包被的24孔细胞培养板上进行RNA提取，10k/150μl心肌细胞8孔载玻片进行免疫荧光染色。
11.2
24小时后将培养基切换为CMM，此后每隔一天刷新一次。
11.3
在分化第28天，用冷DPBS(不含Ca2+或Mg2+)洗涤hiPSC-CMs，纺丝，使用RNeasy Mini Kit分离RNA。然后用qRT-PCR检测心脏基因的表达。
11.4
将载玻片上的心肌细胞固定，并进行免疫荧光染色以评估心脏标志物。
12.
多电极阵列LQT表型分析 
时间:14天
12.1
用50μg/ml的纤维连接蛋白包被Axion BioSystems CytoView MEA 48板2小时(用MgCl2和CaCl2稀释DPBS)。
注:无菌水或DPBS(不含Ca2+和Mg2+)可以添加到板上储层，以增加湿度，防止纤维连接蛋白在培养过程中干燥。
12.2
第14天，将分离的心肌细胞接种于纤维连接蛋白包被的MEA板上(密度为1×10^4/10μl)，用含有1% RevitaCell补充剂的CSM培养24小时。
注意:在这个步骤中，时间是至关重要的。在MEA板上加入一滴心肌细胞，静置约2小时，确保心肌细胞附着。
12.3
将培养基切换为CMM，每隔一天刷新一次。
注意:刷新介质时避免接触电极。
12.4
使用AxIS Navigator软件(版本2.5.1.10)，从分化第17天(在MEA板上复制后3天)每天记录场电位，推荐设置如下。
“流-配置-心脏实时-自发”
数字滤波器:高通0.1Hz，低通2000 hz。
心跳检测阈值:200μV。
最小和最大节拍周期分别为250毫秒和10秒(节拍率为每分钟6至240次)。
FPD方法:多项式回归(计算最大搜索后持续时间为1s的场电位持续时间，以及分别在50ms和70ms的峰值前和峰值后检测延迟时间)。
12.5
测量过程中监测温度，并将温度保持在37℃，以保持离子通道功能稳定，防止离子通道的温度依赖性失调[44]。
注:在介质恢复当天，心肌细胞在37℃和5% CO2下平衡至少1小时，然后记录场电位。
12.6
记录完成后，使用CiPA分析工具(Version 3.1.8)对原始记录的AxIS原始数据进行科学分析。在每口井中只选择一个电极作为黄金通道，用于检测场电位持续时间(FPD)，该电极表现出显著的正或负t波，并反映了每口井中大多数电极的信号[45]。校正后的FPD (FPDc)采用Fredericia的校正公式[46]计算。
电穿孔后，我们立即挑选了192个单iPSCs，并将其植入两个96孔板中。第二天，我们鉴定出91个单细胞存活的孔(细胞存活率为47.40%)。1周后，在69口井中观察到菌落，克隆形成效率为75.82%。对这69个菌落的基因组DNA进行Sanger测序后，6个克隆被证实成功地整合了所引入的目标杂合变异(HRD效率为8.70%)(图S1)。在此之后，对这6个菌落进行了最可能(前14个)脱靶DNA位点的脱靶分析，结果显示未检测到脱靶效应(图S2)。我们承认在未来的工作中可以进一步提高HDR效率，如优化Cas9/gRNA比率，在ssODN设计中引入同义变体和沉默限制性酶切位点等策略。
总体鉴定证实，6个编辑后的hiPSC克隆核型正常，多能性标记(OCT4、SOX2、NANOG、SSEA4、TRA-1-60和TRA-1-81)阳性，具有向3个胚层自发分化的能力。随后，我们将hiPSC克隆分化为心脏谱系，并使用多电极阵列系统测量由此产生的心肌细胞的电生理特性。
总之，我们提供了一种基于rnp的CRISPR/Cas9策略，在野生型hiPSCs中引入杂合变异，随后分化为心脏谱系，进一步进行致病表型分析。这种方法还可以促进从患者来源的hipsc中产生等基因控制系，这在研究疾病基因型-表型比较中的单个核苷酸变量时代表了控制的金标准。CRISPR/Cas9技术与干细胞建模相结合，可用于体外疾病建模、表型比较、药理探索、药物开发以及未来的个性化治疗。
以下是电子补充材料的链接。
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